This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Siden den første beskrivelsen i 2001 av tre uavhengige grupper 1-3 i n utero elektroporering er blitt en utbredt standard verktøy for å analysere genekspresjon i gnagere sentralnervesystemet. Sammenlignet med den generasjonen av knockout-mus, som er, til tross for kontinuerlig forbedring teknikker, fortsatt tid og penger tidkrevende, de i utero electroporation appeller på grunn av sin enkelhet. Så, i utero elektroporering muliggjør rask og effektiv gevinst-og tap-av-funksjon studier 4.
For å transfektere de cerebrale områder, blir oppløsningen inneholdende det negativt ladede plasmidet injiseres i et hjertekammer. I løpet av den elektriske puls, migrerer negativt ladet DNA mot den positive pol, og derfor den transfekterte region kan velges ganske enkelt ved å endre posisjonen til den positive pol. Det har ofte vist seg at tallrike områder av sentralnervesystemet kan være TArgeted 3,5-8. For eksempel, nyere studier viser spesifikke transfeksjoner av hippocampus, piriform cortex eller striatum 9-11. Men informasjonen om de aktuelle stillingene er ofte bare knapt standardisert og er ikke alltid lett å overføre til forskjellige musestammer.
Transfeksjon av visse embryonale stadier er langt fra trivielt. Mange påvirkende faktorer må tas i betraktning når du velger oppsett for spesifikk i utero elektroporering. Først, for å optimalt transfektere de respektive embryonale stadier, er kunnskap om de aktuelle spenninger nødvendig. Høye spenninger redusere overlevelse, mens lave spenninger redusere transfeksjonseffektiviteten 2,3,12. Også størrelsen av elektroden padle spiller en avgjørende rolle, fordi bruken av elektrode årer som er for store resulterer i redusert spesifisitet, eller kan føre til død på grunn av affeksjon av hjerterytmen 4,12,13. Den påførtespenning og størrelsen og posisjonen av elektroden åren er de viktigste funksjoner for å ta hensyn til, men det finnes også ytterligere faktorer som påvirker utfallet av elektroporering som den anvendte mengde av DNA-løsning.
Vi har utviklet en detaljert protokoll som muliggjør rask og effektiv transfeksjon av forskjellige cerebrale regioner av C57BL / 6 mus 12. I denne protokollen detaljert informasjon om de spenninger som skal benyttes og størrelsen av elektrode åren for forbedret spesifisitet er gitt. Videre informasjon om ventrikkel for å bli fylt med anbefalinger for mengden av plasmid-løsning og stilling av elektroden blir tilført. Indikasjon på detaljert posisjonsinformasjon i et kart og den videre visualisering av disse stillingene kan du direkte konkret og effektiv i utero electroporation av retrosplenial cortex, motor cortex, somatosensoriske cortex, den piriform cortex, tHan CORNU ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septal nucleus, thalamus og hypothalamus.
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
The authors have nothing to disclose.
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
Fast Green | Roth | 0301.1 | |
pCAGGS | Addgene | ||
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |