This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.
In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.
Siden den første beskrivelse i 2001 af tre uafhængige grupper 1-3 i n utero elektroporation er blevet en udbredt standard værktøj til analyse af genekspression i gnavere centralnervesystemet. I forhold til generering af knockout-mus, der er, til trods for løbende at forbedre teknikker, stadig tid og penge tidskrævende, de i utero elektroporation appellerer på grund af sin enkelhed. Så i livmoderen elektroporation muliggør hurtig og effektiv GAIN- og tab-af-funktionen undersøgelser 4.
At transficere de cerebrale områder, er opløsningen indeholdende negativt ladet plasmid injiceret i en ventrikel. Under den elektriske impuls, det negativt ladede DNA vandrer mod den positive pol, og derfor den transfekterede region kan vælges blot ved at ændre positionen af den positive pol. Det er ofte blevet påvist, at mange regioner af centralnervesystemet kan være targeted 3,5-8. For eksempel de seneste undersøgelser viser specifikke transfektioner i hippocampus, den piriform cortex eller striatum 9-11. Er dog, at oplysninger om de relevante positioner ofte kun næppe standardiseret og er ikke altid let at overføre til forskellige musestammer.
Transfektion af visse fosterstadier er langt fra trivielt. Mange faktorer skal tages i betragtning, når de vælger opsætningen for specifik in utero elektroporation. Først optimalt at transficere de respektive fosterstadiet, der er behov for viden om de passende spændinger. Højspænding sænke overlevelsesraten, mens lave spændinger reducerer transfektionseffektiviteten 2,3,12. Også størrelsen af elektroden padle spiller en afgørende rolle, fordi brugen af elektrodematerialer paddles, der er for store resultater i reduceret specificitet eller kan forårsage dødsfald som følge af påvirkning af hjerterytmen 4,12,13. Den anvendtespænding og størrelsen og positionen af elektroden paddle er de vigtigste funktioner til at overveje, men der er også andre faktorer, der påvirker resultatet af elektroporation, som den anvendte mængde DNA-opløsning.
Vi har udviklet en detaljeret protokol, som muliggør hurtig og effektiv transfektion af forskellige cerebrale områder i C57BL / 6 mus 12. I denne protokol detaljeret information om spændinger skal anvendes, og størrelsen af elektroden paddle for øget specificitet er tilvejebragt. Endvidere kan information om ventriklen fyldes sammen med anbefalinger til mængden af plasmidopløsning og positionen af elektroden tilføres. Angivelsen af detaljerede position oplysninger i en kort og den videre visualisering af disse positioner muliggør ligetil specifik og effektiv i livmoderen elektroporation af retrospenialis cortex, den motoriske hjernebark, somatosensoriske cortex, den piriform cortex t,han Cornu ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septum nucleus, thalamus og hypothalamus.
This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific r…
The authors have nothing to disclose.
Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
Fast Green | Roth | 0301.1 | |
pCAGGS | Addgene | ||
borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |