JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Биолюминесценция изображений из иммунокомпетентных животной модели для глиобластомы

Published: January 15, 2016
doi:
10.3791/53287
, , ,
1Department of Neurological Surgery,University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery,Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics,Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Abstract

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

Introduction

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.

The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.

Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

Protocol

Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональные использования животных и ухода комитета при Северо-Западном университете и были выполнены в соответствии с стерилизованных условиях. 1. Изменение GL261 клеток с Светлячок люциферазы выражая Reporter Примечание: ВИЧ-1 на основе лентивирусов векторов выражают люциферазы светлячка (Fluc) под контролем селезенки внимание образующего вируса (SFFV) промотора. Ген оптического репортер был клонирован в вектор плазмиды pHRSIN-CSGW-dlNotI. Поддержание 293-Т-клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и GL261 клеток в RPMI среде, дополненной 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 95 % воздуха и 5% углекислого газа (CO 2). Когда культура 293-Т-клеток достигает 80% слияния в Т-75 колбу, промыть клетки один раз телosphate буфера солевым раствором (PBS), без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 3 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонно и собрать все клетки из нижней части колбы. Перенести 3 мл клеточной суспензии трипсином в 15 мл коническую трубку, и добавить 7 мл RPMI среде плоти (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии). Смешайте клеточной суспензии и с 5 мл пипетки. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии из трубы и подсчитать количество клеток с использованием гемоцитометра. Для этого смешайте 100 мкл клеточной суспензии с 300 мкл трипанового синий раствор и вставьте 2 мкл смеси в гемоцитометра. Подсчитайте количество клеток без голубого окрашивания от четырех отдельных видах под микроскопом. Нормальное количество клеток из каждой точки зрения, так как это число представляет 10 4 клеток / мл. Между тем, центрифугирование трубки, содержащей суспензию клеток на 300 мкг в течение 7 минут. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 1,0 х 10 6 / мл. Семенной 2,5 х 10 6 GL261 клетки с 2,5 мл RPMI СМИ в колбу Т-175 с 27,5 мл DMEM (1 день). Через 24 часа, замените носитель с 20 мл свежего DMEM (день 2). Для получения вектора лентивирусов, смешать 54 мкл реагента для трансфекции с 2 мл бессывороточной среды DMEM в течение 5 мин. Добавить 3 мкг затычки-Pol, 3 мкг вируса везикулярного стоматита G оболочки (VSV-G), и 4,5 мкг Fluc (pSIN-Fluc) в среде DMEM с реагента для трансфекции, и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Отбросьте всю смесь ДНК в 293-Т колбу (трет-175) и инкубируют при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 48 ч (день 2). Добавьте 10 мл свежего DMEM в 24 ч после трансфекции (общий объем клеточной культуральной среды 293-Т должна быть примерно 30 мл) (3 день). Чтобы разделить GL261 клетки в24-луночный планшет, промыть клетки один раз ЗФР без Са2 + и Mg2 +, инкубировать клетки с 5 мл трипсина (0,05%) при 37 ° С в течение 5 мин, измельченного в порошок с 5 мл пипетки, удерживая колбу слегка наклонены , собрать все клетки из нижней части колбы, и клетки рассчитывать через гемоцитометра, как на стадии 1.2. Между тем, центрифугировать пробирку при 300 х г в течение 7 мин. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования ячейки гранул со свежим RPMI среде, чтобы сделать GL261 клеточной суспензии при плотности 2,5 х 10 4 / мл. Семя 2,5 х 10 4 клеток GL261 с 1 мл RPMI СМИ в 24-луночного планшета (день 3). Сбор 30 мл лентивирусов супернатанта с помощью 10 мл пипетки из колбы 293-Т (Т-175) на 48 ч после трансфекции и передачи супернатант в 50 мл коническую трубку. Аспирируйте 30 мл лентивирусов супернатант с помощью 50 мл шприца, через шприцевой фильтр 0,22 мкм, и аликвоту супернатанта вируса в 1 мл аликвоты (4 день). Замените 1 мл RPMI среднего GL261 клеток пластины (24-луночные) с 1 мл супернатанта лентивирусов и инкубировать при 37 ° С во влажной камере (4 день). После 48 ч в лентивирусов инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (6 день). Через 24 часа, повторить лентивирусов инфекцию GL261 клеток (7 день). После 2-го 48 ч лентивирусных инфекции, заменить жидкость с 1 мл свежей RPMI с (9 день). Продолжают расти люциферазы модифицированный GL261 клетки (которые будут называться GL261.luc клеток) и расширить культуры клеток к Т-75 колбу. Когда культура GL261.luc клеток достигает 70% слияния в Т-75 колбу, урожай клеток трипсинизацией и рассчитывать на гемоцитометра, как в шаге 1.2. Пластина ячейку GL261.luc в 24-луночного планшета на выпускников плотностей (1,0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 2,5 х 10 4 клеток / лунку) и инкубировать при 37 ° С в увлажняемомFied камеру, содержащую 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерьте сотовой активность люциферазы по отношению к люциферазы модифицированный U-87 MG (U87.luc) клеток с использованием биолюминесценции томография (рисунок 1). Запустите программу изображения (нажмите значок на рабочем столе) и инициализации системы визуализации (нажмите кнопку "Initialize"). Инициализация начнется автоматически и может занять несколько минут для системы проверки и камеры для охлаждения до -90 ° C. Добавить 25 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) в каждую лунку. Инкубируйте клетки с люциферин в течение 1 мин при комнатной температуре и изображения пластины в течение 10 сек. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "люминесцентных", "10 сек" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите 24-луночного планшета на изображения станции и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. После того как изображение будет успешно приобрела, вы увидите окно изображения и инструмент годовыхLette на экране. Нажмите "ROI (области интереса) Инструменты» и выберите 6 х 4 с помощью значка щели. Создать 6 х 4 щели, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении пластинки 24-а и щелкните вкладку измерений (значок карандаша). Соблюдайте окно с таблицей измерений ROI в качестве единицы фотонов в секунду на стерадиан на квадратный см (фотонов / сек / SR / см 2). Использование U87.luc клетки, предварительно модифицированный же лентивирусов, используемого здесь модификации GL261 11, в качестве контроля для оценки активности люциферазы в клетках GL261.luc трансдуцированных. 2. Экстракорпоральное пролиферации Когда клеточные культуры GL261 и GL261.luc до 70% слияния в Т-колбе 75, урожай Обе клеточные линии обработкой трипсином и подсчитать, как на стадии 1.2, и пластинчатые элементы в 96-луночный планшет при плотности 1500 клеток на 80 мкл RPMI среде в хорошо используя многоканальную пипетку, чтобы свести к минимуму время и ошибки пипетирования. Серед каждая клетка линия в общей сложности 20 скважин. Чтобы ограничить испарение в лунках населенных клеток, заполнения пустых лунок 100 мкл свежей RPMI среде. Оценка клеточной пролиферации с использованием колориметрического анализа клеточной пролиферации. Здесь мы используем клеточной пролиферации МТС. Используя пипетку многоканальный, добавить 20 мкл МТС реагента в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки. Инкубируйте планшет при 37 ° С во влажной камере, содержащей 95% воздуха и 5% CO 2 в течение 3 ч. Измерить поглощение при 490 нм с использованием микропланшет-ридера. Это повторяется в дни 1, 2, 4 и 7, после посева. Для нормализации значения абсорбции, значения каждый день делятся на соответствующие показания, полученные в 1-й день (рис 2). 3. имплантации опухолевых клеток Примечание: Автоклав все оборудование. Подготовка хирургического области путем распыления дезинфицирующего (2% раствор хлоргексидина) и накрыть absorbenт. драпировки Для того, чтобы поддерживать стерильные условия, носить стерильные хирургические перчатки во время операции, и разделить хирургическое площадь в двух областях по цвету ленты. Площадь 1 помечен "Чистый" и содержит стерилизованные поставок; Область 2 помечен "Грязные" и содержит использованы материалы. До операции животных, подготовить клеточную суспензию для инъекций внутричерепного. Урожай клетки от 70% сливной Т-75 колбу обработкой трипсином и подсчитать клетки через гемоцитометра, как на стадии 1.2, и сделать клеточную суспензию при плотности 1,0 × 10 5 клеток / мкл в Хэнкса сбалансированном солевом растворе без Ca 2+ и Mg 2+ (HBSS). Обезболить мышей интраперитонеальной инъекции 200 мкл смеси, содержащей 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг ксилазина в 0,9% физиологическом растворе. Чтобы подтвердить надлежащее обезболивание, щепотка палец мыши. Если мышь находится полностью под наркозом, мышь не должна реагировать на раздражитель. Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфин с помощью подкожных инъекций, чтобы облегчить послеоперационную боль. Бритье верхней части головы животных с использованием машинки для стрижки и чистый с хлопком наконечником аппликатором, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Применить глазную мазь, чтобы поддерживать необходимую смазку во время операции. Сделайте надрез сагиттальной длиной около 1 см от теменно-затылочной кости, используя стерильным скальпелем. Для визуализации брегмы, протрите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора, смоченной в 3% растворе перекиси водорода. Дрель череп со стерильным 25-G иглы, чтобы сделать небольшое отверстие 3 мм справа от темени и просто за венечного шва. Чтобы гарантировать, что внутричерепное месте инъекции на глубину 3 мм от черепа, сократить 3 мм ОТ заостренным концом пипетки 20 мкл с помощью ножниц и вставить шприц в пипетки. Вставьте шприц перпендикулярно к отверстию созданной ранее и медленно вводить опухолевых клеток SUSпенсии, содержащий 3,0 × 10 5 клеток в 3 мкл HBSS, в течение 1 мин. Оставьте иглу на месте в течение другой минуты, а затем медленно вытяните иглу. Тампон череп с хлопком-наконечника аппликатора, смоченным в 3% перекиси водорода и 2% раствором хлоргексидина. Высушите поверхность черепа с хлопка наконечником аппликатора. Вырезать из стерильной кости воск приблизительно 3 мм 3 в размере и прикрепить кости воск на торцевой стороне хлопка-наконечника аппликатора. Нанесите воск кости, чтобы покрыть отверстие с хлопка наконечником аппликатора. Нарисуйте каждую сторону головы вместе над черепом с помощью щипцов, и главный, чтобы закрыть рану. Очистите рану ватным кончиком, смоченным в 2% -ном растворе хлоргексидина. Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторно и сохранить нормальную деятельность. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 30 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза. <p cдевушка = "jove_title"> 4. Биолюминесценция Визуализация GL261 опухолевого роста Спрей щедрое количество дезинфицирующего средства (0,05% раствор диметил хлорида аммония) на чистую бумажным полотенцем. Используйте дезинфицирующее пропитанной бумажной салфеткой, чтобы вытереть тщательно черный лист, конусы и делитель внутри изображения камеры, где животные будут находиться в контакте с устройством. Тщательно протрите все поверхности чистой сухой бумажной салфеткой. Повторите это еще раз и ждать 5 мин. Инициализация изображения станцию, как в шаге 1.14.1. Обезболить мышь с 300 мкл смеси, содержащей 200 мкл / ксилазина Кетамин и 100 мкл люциферин (D-люциферин калиевой соли, 150 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Подождите 10 минут после инъекции и подтвердить, если мышей полностью под наркозом, зажимая хвост. Чтобы настроить систему визуализации, выберите "Люминесцентные", "Auto" время экспозиции, и «средний» биннинга. Поместите мышей на стати изображений, и нажмите кнопку "Снимок", чтобы начать изображение. Убедитесь, что время после инъекции согласуется с каждой сессии изображений. После того как изображение будет успешно приобрела, должно появиться окно изображения и палитра инструментов. Нажмите кнопку "ROI Инструменты" и выберите "Auto" в виде круга. Чтобы определить трансформирования, окружить площадь сигнала на изображении, а затем проводить измерения ROI в качестве единицы фотонов / сек / SR / см 2. Возьмите мышей из изображения камеры и контролировать мышей, пока они не стали, передвигающихся и сохранить нормальную деятельность. Обычно время восстановления составляет приблизительно 15 мин. Не вернуть мышей в клетку с другими животными, пока они не полностью оправился от наркоза. Монитор роста опухоли визуализации биолюминесценции два раза в неделю, пока животные не представляют следующие симптомы: потеря веса (потеря более 20% по отношению к весу до имплантации), отсутствие аппетита (анорексия полная в течение 24 часов), а также отсутствие устойчивого purposefuл ответ на нежной стимулов (слабая попытка встать), и в это время они должны быть умерщвлены. Эвтаназии животных с этими симптомами с использованием СО 2 камеры с последующим смещением шейных позвонков. Место мышей в камере эвтаназии (не переполнены камеры) и приток сжатого CO 2 в течение 5-6 мин. Заметим, что все животные сознания и не дышит примерно через 5 мин. Возьмите мышей из камеры. Убедитесь, что сердце не бьется, чувствуя грудь между большим и указательным пальцами и убедитесь, что нет мигают рефлекс. Задержите мышь в положении лежа на плоской поверхности и понять затылок в основании черепа с одной стороны, и основания хвоста с большим и указательным пальцами другой руки. Задержите голову и быстро вытащить хвост назад. Убедитесь, что череп отделяется от первого шейного позвонка, используя ваш большой палец и первый палец. НормаAlize значения люминесценции на каждый день от соответствующих показаний, полученных в первый день съемки биолюминесценции как на этапе 2.3 (фиг.3А). Для статистического анализа, генерации кривых выживаемости, используя Kaplan-Meier оценивания 12 и сравнить различия между кривыми выживаемости с использованием лог-рангового 13.

Representative Results

GL261 клетки были инфицированы люциферазы, содержащей лентивирус, как описано выше в шагах 1. В пробирке биолюминесценции изображений демонстрирует сильную экспрессию люциферазы, похожий на уровнях положительного контроля U87.luc линии клеток глиобластомы человека (рис 1). Как и ожидалось, неинфицированных клеток GL261 не демонстрируют выражение фон люциферазы. Этот шаг является простой, но решающее значение для выполнения до дальнейших исследований с использованием зараженного клеточную линию, чтобы подтвердить стабильную экспрессию люциферазы. Люциферазы выражение после внутричерепного имплантации. Перед внутричерепного имплантации, мы не выявили никакой разницы в пробирке темпов роста по сравнению с GL261.luc GL261 клеток (рисунок 2). Для внутричерепного роста и анализа выживаемости клетки вводили в брAINS из мышей C57BL / 6 согласно протоколу Шаг 3. Рост опухоли у мышей, несущих опухоли GL261.luc серийно анализировали изображений биолюминесценции использованием протокола шаг 4 и продемонстрировали обнаруживаемого роста опухоли (фиг.3А). Мыши быстро и последовательно, несущие опухоли GL261.luc стал умирающий и умерщвляли. Важно отметить, что нет никакой разницы в общей выживаемости между GL261.luc и GL261 животных с опухолью (фиг.3В). Поэтому в естественных условиях биолюминесценции изображений может быть использован для мониторинга ответа на экспериментальных процедур глиобластомы. Быстрое надежное рост опухоли и короткий общей выживаемости может дать большие объемы данных в относительно короткий промежуток времени. Рисунок 1. Активность люциферазы в клетках GL261.luc. U87.luc, GL261.luc и GL261 (отрицательный контроль) клетки высевали при плотности1.0 х 10 6, 5,0 х 10 5 2,5 х 10 5 1,0 х 10 5 5,0 х 10 4 и 2,5 х 10 4 клеток / лунку слева направо. Люминесценция (фотон / сек / SR / см 2) была измерена с помощью изображений Lumina станции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Выражение люциферазы не влияет пролиферацию клеток GL261. GL261.luc клетки не вызывают Разница в пролиферации, как показано на МТС клеточной пролиферации. График показывает кратное увеличение, по отношению к 1 день, а определяется путем сравнения среднее значение оптической плотности (среднее ± SEM) в момент времени thespecified к среднему значению в 1 день (неспаренных значения Т для -test сравнениймежду каждой клеточной линии: Р = 0,7796) 14. Усы представляют собой средние значения (среднее ± SEM) от четырех экземплярах образцов на каждый день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Выражение люциферазы дозы не влияет на в естественных условиях роста опухоли и выживания животного. (А) контроль Биолюминесценция демонстрирует поступательный рост внутричерепного опухоли GL261.luc в C57BL / 6 мышей. (Б) анализ выживаемости Каплана-Мейера не демонстрирует никакой разницы в общей выживаемости для мышей, имплантированных интракраниально либо с GL261 (сплошная линия) или GL261.luc клеток (пунктир).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

GL261 мышиный Клетки глиомы, при имплантации в сингенных интракраниально иммунокомпетентных мышей C57BL / 6, имеют несколько преимуществ по сравнению с моделями ксенотрансплантата человека животных глиомы. Многие из ксенотрансплантированной опухолей растут в виде инкапсулированных повреждений, которые точно не повторять инвазивный болезни человека. В отличие от этого, опухоли GL261 не только демонстрирует вторжение в соседнее мозга, но и образование новых сосудов, митотических фигур, и глубокое некроза 7. Наиболее важно при изучении иммунологии опухоли или иммунотерапевтических стратегии 15, 16, C57BL / 6 мыши сохраняет нетронутыми иммунной системы 8. Предыдущие исследования показали, надежную экспрессию цитокинов иммуносупрессивной TGF-бета и внутричерепные опухоли содержат иммуносупрессивных Т-регуляторные клетки, похожие на человека глиобластомы 9, 10.

Простой метод, описанный здесь позволяет стабильной экспрессии люциферазы по GL261 клеток. Мы недавно сообщили СимиLAR в пробирке и в естественных условиях роста клеток GL261.luc сравнению с GL261 клеток, в дополнение к аналогичным характеристикам опухоли гистологических и иммунной клетки проникают 17. GL261.luc клетки, стабильно выразить люциферазы, который катализирует окисление субстрата люциферин преобразования химической энергии в фотоны и, следовательно, детектируемого света. Люциферин можно безопасно вводить животным и пересекает гематоэнцефалический барьер после внутрибрюшинного или внутривенного введения. В небольших лабораторных животных, таких как мыши, биолюминесценции могут быть обнаружены снаружи в неинвазивным способом 11. Таким образом, рост опухоли может быть оценена последовательно без необходимости принесения в жертву животных или дорогостоящего МРТ или КТ.

Критические шаги в протоколе включать, не только Lentiviral трансдукции, но и проверку стабильной экспрессии люциферазы в пробирке до начала каких-либо естественных условиях в эксперименты. Потеря трансдукции может requiRe повторного лентивирусом инфекции. Введение гена резистентности к антибиотику в вектор экспрессии также могут быть использованы для отбора экспрессии люциферазы. Тщательное техники требуется для внутричерепного имплантации воспроизводимо место последовательное число клеток в точном анатомической локализации, чтобы позволить сравнение различных группах лечения. Основное различие между текущей и исследования предыдущих исследований люциферазы экспрессирующих клеток GL261 является использование свободного техники рук для имплантации клеток по сравнению с использованием стереотаксической рамки 18. Ранее мы показали стабильные результаты имплантации свободной технике ручной 19. Преимущество свободной технике ручной является возможность выполнить высокую пропускную способность анализ различных агентов обработки. В наших руках, мы можем имплантировать около 60 животных в 1 ч.

После овладения техникой, будущие приложения в технике безграничны. Как GL261 demonstrАтеш повышенные митозы и быстрый рост опухоли похожи на человека глиобластомы, анти-пролиферативные лечения могут быть оценены. Аналогично, анти-инвазивные и антиангиогенные терапии могут быть использованы в качестве GL261 опухоли инвазивных и ангиогенных. С осторожностью следует применять при оценке влияния химиотерапевтических агентов, направленных на человека целей. По сравнению с предыдущими исследованиями с использованием глиобластомы человека, выражающие ксенотрансплантаты люциферазы 20, это будет рассматриваться как ограничение нашей модели. Кроме того, эффект иммунотерапии стратегий роста опухоли могут быть изучены в ксенотрансплантированной модели GL261.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

Materials

D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechonology LUCK-100 Store away from light
Living Image Software Caliper Life Sciences Contact for Quote none
Xenogen Lumina Caliper Life Sciences Contact for Quote none
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom Falcon 353047
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 none
Synergy 2 Multi-Mode Reader BioTek Contact for Quote none
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed Coster 3603 none
Ketaset Pfizer NDC 0856-2013-01 Control substance
Xylazine Sigma-Aldrich 23076-35-9 none
28G Needle (with syringe)  Fisher   22-004-270 AKA Insulin Syringe
2% Chlorhexidine Fisher NC9756995 AKA “Nolvasan”
3% Hydrogen Peroxide Fisher H312P-4 Store away from light
Ophthalmic Ointment Cardinal Health 1272830 AKA “Akwa Tears”
25G 1 1/2 needle BD Becton Dickinson 305127 none
Disposable Scalpels Feather 2975 No. 21
Gauze Fisher 22028563 Autoclave before use
Heating Pad Dunlap HP950 none
Skin Stapler, Staples, Remover Stoelting 59020 none
PDI Alchol Prep Pads Fisher 23-501-711 none
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack Brain Tree Scientific, INC 203 1000 Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Applier Brain Tree Scientific, INC 204 1000 Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Remover Brain Tree Scientific, INC 205 1000 none
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle Qosmedix 10107 Autoclave before use
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) Gibco 14170-112 none
Hamilton Syringe Hamilton 80300 none
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2961 none
Bone Wax Harvard Apparatus 599864 none
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. . Statistical Methods in Medical Research. , (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Tags

Bioluminescence ImagingImmunocompetent Animal ModelGlioblastomaGL261 Murine Tumor CellsLuciferase ModificationTumor Cell ProliferationIn Vivo MonitoringTumor GrowthImmunotherapyIn Vitro Proliferation AssayMTS ReagentAbsorbance Measurement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (107), e53287, doi:10.3791/53287 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image