Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano
Summary
The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Abstract
Colture organotipiche permettono la ricostituzione di un ambiente 3D critico per interazioni di contatto cellula-cellula e cellula-matrice che imita la funzione e la fisiologia dei loro omologhi dei tessuti in vivo. Questo è esemplificato da culture pelle organotipiche che riassume fedelmente la differenziazione epidermica e il programma di stratificazione. Cheratinociti epidermici primari umani sono geneticamente manipolabile attraverso retrovirus in cui i geni possono essere facilmente overexpressed o abbattuti. Questi cheratinociti geneticamente modificati possono poi essere utilizzati per rigenerare epidermide umana in colture organotipiche della pelle che forniscono un modello potente per studiare percorsi genetici di crescita epidermico impattante, la differenziazione e la progressione della malattia. I protocolli qui presentati descrivono metodi per preparare derma umano devitalizzati nonché manipolare geneticamente cheratinociti umani primari per generare culture organotipiche pelle. Pelle umana rigenerata può essere utilizzato in downstrapplicazioni EAM come il profilo di espressione genica, immunostaining, e immunoprecipitazioni cromatina seguiti da sequenziamento ad alta produttività. Così, la generazione di queste culture organotipiche pelle geneticamente modificati consentirà la determinazione di geni cruciali per mantenere l'omeostasi della pelle.
Introduction
L'epidermide umana è un epitelio stratificato che si collega al derma sottostante attraverso una matrice extracellulare noto come l'epidermide zone.The membrana basale non serve solo come una barriera impermeabile per evitare la perdita di umidità, ma anche come una prima linea di difesa per proteggere la corpo dalle sostanze estranee e tossiche 1. Lo strato basale, che è lo strato più profondo dell'epidermide, contiene le cellule staminali epidermiche e progenitrici che danno luogo alla progenie differenziata che formano il resto dell'epidermide 2. Come le cellule progenitrici epidermiche differenziano migrano verso l'alto per formare il primo strato di cellule differenziate note come strato spinoso 3. Nello strato spinoso, cellule attivano l'espressione di cheratine 1 e 10, che quindi fornisce la forza di resistere allo stress fisico per gli strati differenziati dell'epidermide. Come le cellule strato spinoso ulteriormente differenziano, si muovono verso l'alto nell'epidermide a perm strato granulare che è caratterizzata dalla formazione di keratohyalin e lamellari granuli così come proteine strutturali che vengono assemblati sotto la membrana plasmatica. Poiché le cellule procedere nel processo di differenziazione, le proteine sotto la membrana plasmatica sono trasversali collegati tra loro, mentre i granuli vengono estrusi lamellari dalle cellule per formare una barriera lipidica ricco chiamato strato corneo 4.
Malattie che coinvolgono alterazioni nella crescita epidermico e impatto differenziazione ~ 20% della popolazione 5. Così, la comprensione dei meccanismi di questo processo è di grande importanza. Dal momento che la manifestazione di molte di queste malattie è subordinato cellula-cellula o cellula-matrice contatto, colture organotipiche dove l'epidermide umana è ricostituito in un ambiente 3D sono stati creati 6-10. Questi metodi tipicamente comportano l'uso di cheratinociti primari o trasformati seminate su matrice extracellulare come devitalizzati umanaderma, Matrigel o collagene.
Per comprendere gene meccanismi di regolamentazione che sono importanti nella crescita e differenziazione epidermica, cheratinociti possono essere geneticamente manipolati tramite vettori retrovirali per atterramento o iperespressione di geni nella cultura 2D e poi ricostituito in 3D. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare i geni coinvolti nella epidermica staminali e cellule progenitrici auto-rinnovamento e la differenziazione, nonché la progressione di neoplasia 11-21. Qui, è previsto un protocollo approfondito su come modificare l'espressione genica in colture organotipiche epidermiche attraverso l'uso di retrovirus.
Protocol
Representative Results
Discussion
La manipolazione genetica in pelle umana colture organotipiche offrono molti vantaggi a comunemente studiato 2D cellule in coltura e modelli di mouse. Culture 2D mancano i tre cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare interazioni dimensionali si trovano in tessuti e organi intatti. Recenti studi hanno anche trovato enormi differenze tra le colture di cellule tumorali della pelle 2D e 3D con le cellule in coltura 3D che mostra molto di più somiglianze di espressione genica per la pelle umana primaria tumori …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportedby l'American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) e il Premio Biologia CIRM di base (RB4-05779).
Materials
| Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
| PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
| amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
| FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
| Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
| DMEM | GIBCO | 11995 |
| Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
| FBS | GIBCO | 10437-028 |
| Adenine | Sigma | A-9795 |
| Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
| Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
| Insulin | Sigma | I-1882 |
| EGF | Invitrogen | 13247-051 |
| Transferrin | Sigma | T-0665 |
| Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
| cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
| Matrigel | Corning | 354234 |
| Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
| square pegs | Arts and crafts stores | |
| human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
| human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
| MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
| LZRS retroviral vector | Addgene | |
| pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |
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