运动性的时空制图<em>离体</em肠子>准备工作

弗吉尼亚联邦大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了该协议中使用的所有动物安乐死程序。 1.准备解决方案制备4L的Krebs缓冲液（[以mM]组成：118氯化钠，氯化钾4.75，1.19 KH 2 PO 4，1.2 MgSO 4干燥，2.54 氯化钙 ，25的NaHCO 3，11葡萄糖）。称出各固体化学，投入去离子水的适当体积的适当的量和混合用涡旋直至溶液澄清。 然后，充气与carboxygen（95％O 2，5％CO 2）30分钟，同时加热至37℃的溶液中。 确定溶液的pH值，同时在37℃下（相同的温度，在器官浴），并在必要时使用的HCl调节至pH 7.4。保持Krebs缓冲液连续carboxygenated并在37℃下整个实验的长度。 放从蠕动泵入缓冲储水并打开蠕动泵的流入和流出管，以开始在整个管道和器官浴系统中的缓冲器的灌注。 注：缓冲器最初可以抽回到原来的容器，直到除了任一组织的成器官浴或化学物质进入灌注缓冲液中。这减少了缓冲的需要进行实验的总量。随后传出缓冲区灌注线应该放到一个空的容器，这样的迁入和传出缓冲区不要混用。 校准加热系统的温度对循环器浴使得器官浴内的缓冲区变，并保持37.0±0.5℃下进行的实验的持续时间。确认，并把组织片段在浴在步骤2.8之前至少一个更多的时间，如果必要修改，克雷布斯缓冲液的pH。 2.准备工作组织的安乐死豚鼠通过在密封腔或经当地动物护理和使用委员会另一种安乐死​​方法使用吸入二氧化碳/窒息。 确认动物安乐死后，纵向切开与剥离剪刀打开腹壁并找到肠子。剪下贴在小肠，帮助揭露盲肠肠系膜。 注：要确认所批准的动物护理和使用委员会安乐死执行辅助程序如双侧开胸手术。 定位盲肠的远端和横切近端结肠只是远端到其盲肠连接。然后横切近端结肠再次〜8厘米远离第一横断。 将结肠组织到温暖和carboxygenated克雷布斯溶液（第1节）为进一步解剖。引脚上的大肠放入夹层浴和使用一套剪刀小去除尽可能多的肠系膜和脂肪越好。 以heated夹层托盘，轻轻灌注通过使用耦合到平端的导管的注射器内腔Krebs缓冲液中删除所有腔内含量（以帮助防止组织的穿孔）。在此过程中灌注避免过度扩张段。 获得两个火抛光玻璃管导管（3-毫米直径），并放置一段短的聚乙烯管（约3毫米长和〜3毫米的直径）周围进入组织腔的玻璃管的一部分。 注意：这将允许缝线放置组织周围和玻璃管保持安全和不滑，作为准备放入器官浴中，并在改变的组织的长度。 插入一个导管进入组织制剂的口腔端和领带围绕小片管周围使用外科医生的结导管的缝合。轻轻尝试将导管退了出去，确保结舒适。然后，执行另一导管进入T中的同一个动作他反口组织的结束。 一旦导管固定，移动从解剖盘的整备（组织加导管）到器官浴之一。将制备成朝向远离用户的口头端浴。 未来由两个建议的方法之一安装/固定玻璃管导管向器官浴。 注：保护玻璃管防止所述组织段从实验期间改变长度或未来上述Krebs缓冲液，在浴的表面水平。 选项​​A：通过使用模塑的粘土或塑料夹子的固定玻璃管到塑料器官浴的一侧的顶部的顶部部分。 选项​​B：固定玻璃管子，通过使用塑料夹守稳器官浴准备相机的金属杆。 一旦导管被固定到浴，附加一个5厘米的管件的每个导管的开口端。对于口服猫海特，附上该管连接到一个10毫升的注射器，其将用于缓冲注入近侧结肠段的内腔中。为反口导管，该管件将允许管腔流出到被引导到一个收集容器（50毫升烧杯中，水库等 ）。 使用连接到口腔端的注射器，慢慢冲洗穿过组织管腔温热Krebs缓冲液，以确保液体可以流过所述组织。流由液体离开所述反口导管证实。校准视频记录系统（协议第3节）而组织达到平衡30分钟。 3.校准视频记录系统校准摄像机高度放置，视频设置为亮度和对比度，并使用该软件的水平距离。 注：对于腔内灌注设置的最佳设置比来确定小球推进13的速度的设定不同。 CLI放摄像机的实验片上进行校准。然后在“文件”菜单中，单击“校准”。 一旦视频出现在“校准工作站”窗口中，将相机对准一个高度，其中图像包括插入到结肠腔导管的末端。 然后，校准用附在每个浴半透明标尺贴纸图像中观察到的水平距离。 注：此校准是至关重要的管腔直径和收缩波的速度更新版本的软件计算。 在相同的“校准工作站”窗口中，将红色垂直指引，让他们10毫米的间隔根据相机图像中的统治者。然后，键入适当的距离（10毫米）到“远方光标”窗口，点击“CAL”按钮。 接着，调整增益，亮度，和“校准工作站'窗口内活门滑块以修改，以使摄像机图像组织段显示为黑色的剪影在浅色背景。 注： 图4显示了这种校准过程中好的和坏的例子。 要适当调整图像，也可以调整相机本身的对焦和光圈旋钮。 校准现已完成。点击“保存”，然后点击“确定”，在弹出窗口中，最后点击“退出”按钮。 4.一般实验方法经过摄像机标定程序和组织平衡30分钟完成，命名中的每个实验方案的实验。试用名称可以根据名称和化合物和液体体积的浓度的那部分在实验过程中被intraluminally灌注到组织片段。 然后，闭塞管从反口导管通过使用管夹的突出。 注意：这可以防止管腔液体离开福在反口端rther实验，允许在管腔使用特定体积的挑起各级腹胀的（ 图1）。 注入约的Krebs缓冲液0.7 ml，在近端结肠腔，以提供足够的腹胀启动推进收缩在豚鼠离体的准备。 注意：此卷可能略有不同（0.1 – 0.2毫升）根据完好分段的总长度和拉伸的施加于分段在器官浴中的量。 一旦该段被管腔液 ​​胀得，打开相机，然后记录运动的时间预先确定的时间段（如10分钟）。 具体来说，双击适当命名的审判开了实验相机视图，然后单击切换开关置于“ON”位置，查看相机领域。然后，点击录音键开始录音（录音键仍为红色，而相机记录）一第二再次单击录制按钮停止录制。 在这一初始控制腹胀试验结束时，松开/拆下钳闭塞反口导管，以允许所述组织段来推进肿胀液体流出腔。 后10分钟的再平衡时间，重复此过程与任何各种营养素，生物活性剂，药物，或激动剂/拮抗剂的管腔液 ​​的修改段（例如，短链脂肪酸或癸的推进运动酸）10,18。 为了帮助轨距当新的实验流体进入结肠段，离开气泡靠近注射器的端口，以便于新溶液进入结肠腔的气泡的进展的灌注将允许用户知道实验流体时已到达内腔。 继续腔内灌注与反口导管打开，直到泡沫完全推通过腔内灌注系统（可能需要2-3灌注液毫升）。然后，让所述组织段通过打开的反口导管排出流体达5分钟。 注意：在这个程序之后，管腔将包含流体的可忽略的量，允许已知体积的液体进入腔的灌注。 再闭塞使用管夹的反口管腔导管管（如在步骤4.3）注入肿胀流体在通过注射器的控制条件相同体积。记录实验期间购买的分析和比较，以控制克雷布斯条件的运动模式（如在步骤4.5）。 重复第4.4 – 4.7与不同的腔化合物或不同浓度相同的管腔化合物的协议。 5，建设时空地图的（STmaps） 记录实验完成后，双击一个特定试验的名称以打开分析风流建设的STMAP的。 在视频播放方面，调节对比度和亮度滑块在分析窗口，使图像适合于分析（黑色组织剪影背景光; 图4）。 注：如果在开始实验的图像只能在这一点上进行修改，以在较小的程度之前不进行照相机校正适当。 一旦图像被适当对比，在视频图像窗口内设置的水平和垂直红色准则来隔离组织区域进行分析，并除去含有伪影区域。另外，通过确定启动时选择从记录在适当的时间段，并停止的时间点进行分析。 具体而言，使用分析软件中绿色的“A”和黄色的“B”按钮选择视频中的起点和终点。将时间滑块移动到视频片段的起点来分析和n点击绿色的“A”按钮。然后，将滑块移动到段的末尾来分析和点击黄色的“B”按钮。 接下来，单击“马达分析”选项卡打开STMAP窗口，然后单击“秒表”按钮。点击秒表后，点击旁边的录制的电影中的组织的黑色剪影中的十字光标开始STMAP产生。 点击在组织轮廓的十字线后，软件生成并显示STMAP视频的该区域。 注意：这可能需要根据视频选择用于分析的长度几分钟。 点击'放大'，以查看STMAP和控制的放大图像来调整图像。 单击新建窗口中的“颜色”选项，以查看STMAP颜色代替灰度。同样，点击“启用”选项，可以将地图和v中的光标移动的具体像素IEW管腔直径的变化对于特定组织区域的跟踪。完成后，单击“退出”。 导出STMAP用于论文或演讲，或通过选择“文件”菜单，然后选择“导出数据”，然后“元文件”进一步分析ImageJ的。然后命名STMAP，将被保存为的.emf文件，然后单击“保存”按钮。 或者，通过捕捉的屏幕截图保存STMAP的图像。这是必要的保存STMAP的伪彩色版本。 收缩波速在STmaps 6.分析分析收缩传播或收缩持续时间的速度，首先STMAP的.emf文件转换为.tiff，.gif注意，.jpg或.BMP格式都可以接受的ImageJ通过选择的文件转换程序。 注：ImageJ的不开从软件的STmaps的.EMF格式输出。 可选择性伊利，使用截屏抓图软件采取在屏幕上STMAP的画面并将其保存在适当的文件格式。 然后打开ImageJ的重新格式化STMAP，然后打开“插件”菜单并选择“GIMMProcessor打开GIMMProcessor插件”。这将打开两个“GIMMProcessor”和“测量表”窗口。 点击ImageJ的窗口中的“矩形选择工具”，然后用它通过点击并拖动比例尺的整个区域的STMAP的右上角勾勒。之后选择该区域，单击插件的“校准设置”按钮。最后，插入适当的距离（mm）和时间（秒）进入校正盒根据对比例尺的值，然后单击“完成”。 接下来，单击ImageJ的窗口中画线工具。通过一传播收缩沿着第角的中心吸取STMAP的线Ë斜坡通过点击并拖动STMAP形象。另外，画一条垂直线，通过非传播收缩带，以确定收缩持续时间。 之后该行适当绘制（只有一条线可以在同一时间内得出），点击“开始测量”按钮，在插件生成一个读出的水平距离的线，垂直距离和斜的;它们分别对应于长度（mm），时间（秒）和速度（毫米/秒）。此数据显示在“测量表”的窗口。 重复的画线分析步骤给定STMAP中多次和数据保存为.gmd文件。点击插件“保存”按钮，并命名该文件。然后点击“保存”再次以完成该过程。这些数据随后可以与其它试验的数据进行比较，或用于重新画线上的ST​​MAP。