마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가<em> 체외</em

1. 문화 조건 집계 이전 CO 2월 21일부터 25일까지 37 ℃에서 가습 인큐베이터에 젤라틴 코팅 25cm 2 조직 문화 처리 된 플라스크에 ESLIF 매체에 mESCs을 (제제에 대한 특정 재료 및 장비의 표 참조)를 유지하고 5 %. 이 프로토콜에서 사용하기 전에 해동을 게시 적어도 두 구절에 대한 세포를 성장; 낮은 통로에서 세포 실험 복제를 통해 재현 특성을 생성에 일반적으로 더 성공 (즉., 문화에 더 이상 15 유로), 다른 ES 세포 라인 사이 그러나 약간의 변화가 (참조 예상 할 수있다 테스트 세포주 표 2 ). 40 % -60 %의 포화 상태로 세포를 성장. 집계 오버 합류 세포를 사용하지 마십시오. 집계의 2 세대 사전 따뜻한 PBS (+ 칼슘 + 마그네슘 2+), ESLIF, N2B27 (26, 27) </su37 ° C의 물을 욕조에 P>와 트립신 – EDTA. 조직 배양 플라스크에서 대기음 배양 배지 (단계 1.3). 두 번, 5 ml의 PBS로 조심스럽게 플라스크를 씻어. PBS를 기음과 세포를 떼어 놓다 1 미리 예열 트립신 – EDTA (0.25 %) ml의 2를 추가합니다. <5 분 또는 세포가 완전히 플라스크의 표면에서 분리 될 때까지 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. 피펫까지 정확한 계산하고 균일 한 골재 크기의 형성을위한 단일 세포 현탁액을 생성하는 1 ML의 피펫 아래. 5 ~ 10 ml의 ESLIF와 트립신을 중화; 세포 회수를 최대화하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 전송할 성장 표면을 씻어 내린다. 원심 분리 관에서 1 ML의 나누어지는을 제거하고 혈구와 세포를 계산합니다. 세포를 10 / μl를 제공해야 현탁액의 부피를 (전체의 96 웰 플레이트를 5 ㎖ 현탁액에 5 × 104 세포를 요구한다)을 결정. 큰 deviat으로, 정확하게 세포를 계산명시된 세포 수로부터 이온 악영향 자극 응집체의 응답에 영향을 미칠 수있다. 5 분 ~ 170 XG에 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브와 스핀에 5 ml를 미리 예열 PBS에 5 × 4 셀을 추가합니다. 조심스럽게 PBS를 대기음 및 5 mL를 추가 PBS를 부드럽게 미리 예열; 튜브의 하단에있는 펠렛을 방해하지 않습니다. 5 분 ~ 170 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 두 번째 PBS를 대기음. 나쁜 집계에 영향을 미칠 수있는 PBS 이월로 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 필요한 부피 N2B27 더 첨가하여 균일 한 세포 현탁액을 생성 P1000 피펫으로 1 ml의 따뜻한 N2B27에 먼저 펠렛을 재현 탁 (예를 들어, 5 × 4 셀 / 5 ㎖ 현탁액 4 ml를 추가). 멸균 저장조에 세포 현탁액을 전송하고 처리되지 않은 조직 배양의 각 웰의 바닥에 40 μL 방울을 피펫 '96 w를 U'는 바닥멀티 채널 피펫을 사용하여 엘 판. 해당 뚜껑 96 웰 플레이트를 커버하고 반전 벤치 탑 현미경 (그림 1B)와 세포의 존재를 확인합니다. 주 :이 판은 부착 세포의 수를 제한하는 데 사용되는 것이 필수적이다. 하지 피막을 젤라틴, 피브로넥틴 또는 세포 부착을 촉진 다른 코팅 된 96- 웰 플레이트의 바닥을한다. 집계 CO 2, 37 ℃에서 가습 된 배양기에서 48 시간 동안 세포를 인큐베이션하고, 5 %. 3. 자극을 적용하고 중간 변경 48 시간의 인큐베이션 기간 후에, 성공적인 응집 (도 1E)를 확인하기 위해 96 웰 플레이트의 각 웰 내에 mESCs의 외관을 관찰한다. 참고 : 집계 자연 구형 직경 약 150 ~ 200 μm의 표시됩니다. 문제는 (표 1) 발생하는 경우 문제 해결 섹션을 참조하십시오. 0 (N2B27 19에 3 μm의 Chi99021 (치) DMSO에 10 밀리미터에서 준비 주식) 150 μL 신선한 보조 매체를 추가 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 충분한 힘으로 피펫은 우물의 바닥에 부착하기 시작했습니다 수있는 집계을 제거합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 (그림 1A)에 가습 배양기에서 24 시간 동안 보조 매체에서 집계를 품어. 참고 : 재현 연장 및 편광 집계는이 보조 매체를 사용하여 생성됩니다. 다른 이차 배지 조성물은 또한 실험 조건 요구 및 실시 예는도 3에 도시된다에 따라 사용될 수있다. 이후 중간 변경, 부드럽게 잘 각각의 측면에서 보조 매체의 150 μl를 제거하는 각도 (약 30도)에서 열린 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 그런 다음, 충분히 힘으로 각에 N2B27 신선한 피펫 150 μL 시작을 가질 수있는 집계을 제거하는ED는 우물의 바닥을 준수합니다. 시간 코스까지 매 24 시간 반복 포인트 3. 3가 완료 (총 배양 실험의 전형적인 길이는 120 시간이다). 참고 : 확인 집계 자유롭게 내에서 각 96 웰 플레이트 사이에 재현성과 일관성을 보장하기 위해 매체의 변화에​​ 따라 이동하고있다. 중간 집계 기간 다음 매일 변경해야합니다. 공 초점 현미경으로 면역 염색 및 분석을위한 골재 4. 준비 고정 및 기본 항체 인큐베이션 주 : AK Hadjantonakis (28)에 의해 설명 된 프로토콜은 MESC는 집계의 면역 염색에 맞게 수정되었습니다. 우리의 연구와 자신의 희석에 사용되는 일반적인 항체를 들어, 이전에 작업 19,21,24,25,29 표 3 게시를 참조하십시오. 각도에서 열린 멀티 채널 피펫을 사용하여 (약 30 °)를 부드럽게 쪽 (O)에서 150 μL 매체를 제거합니다96- 웰 플레이트의 각 웰 F. 물론 각에 150 μL PBS를 피펫 팅에 의해 두 번 씻으십시오. 집계가 정착 할 수 있도록 각 세척 사이에 몇 분을 남겨주세요. 200 μl를 분배 해당 피펫 팁을 부착하고 멸균 가위와 팁의 끝에서 약 3mm을 차단 P1000 피펫을 설정합니다. 끝으로 96 웰 플레이트의 각 웰 내에 짧은 방법을 PBS의 부분을 그리고 골재를 교반 할 추방. 잘 잘 소형 (30mm 직경) 유리 초파리 절개로 집계과 피펫을 포함하여 내 전체 볼륨을 작성하기 위해 같은 팁을 사용합니다. 잘 같은 유리 해부에 동일한 면역 체계를 받게 될 것이다 96 웰 플레이트에서 모든 집계를 전송합니다. 참고 : 골재의 이월을 방지하기 위해 다른 실험 조건에서 집계를 전송할 때 새로운 컷 피펫 팁을 사용합니다. aggregat이 들어있는 유리 잘 배치해부 현미경 상으로 말이지. 유리 파스퇴르 피펫으로 웰의 일측으로부터 중심과 흡 PBS로 집계를 강제로 잘 유리 소용돌이 친다. 집계가 흡입되지 않도록하기 위해 현미경을 사용합니다. 건조되는 것을 방지하기 위해 집계를 충당하기 위해 유리 잘 내 PBS의 작은 볼륨을 남겨주세요. 1 ml의 새로 제조 된 포름 알데히드 (4 %) PBS에 용해 낮은 속도로 설정 궤도 진탕 기에서 4 ℃에서 2 시간 동안 부화를 추가합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 알레르기 발암 및 독성 것으로 알려져있다. 처리하는 동안 적절한 보호구를 착용 할 것. 제 1 섹션 4에 기술 된 바와 같이 고정 후, 동일한 방법으로 포름 알데히드 용액을 흡인하고 낮은 속도로 설정 오비탈 진탕 기에서, 각 세척에 대해, 1 ml의 PBS로 3 회 10 분 세척 집합체. 제 1 섹션 4에 기술 된 바와 같이 PBS를 흡인하고 PBS 10 % 태아 소 혈청 및 0.2 % 트리를 포함하여 상기 세, 10 분 세척을 수행톤 X-100 (PBSFT). 낮은 속도로 설정 궤도 진탕 기에서 10 분 세척을 수행합니다. 주 : 우유 사용한 경우 그렇지 않은 프로토콜 동안 손실 될 응집체의 수를 감소, 맑은 세척 완충액에서 태아 소 혈청 (FBS)을 사용하여 결과. 그것은 고정 다음, 면역 절차 아래 설명 이외 다양한 방법으로 수행 될 수 있으며 결정에 의해 최적화 조사자되어야한다는 것이 중요하다. 낮은 속도로 설정 궤도 로커에 PBSFT에서 4 ° C에서 1 시간 동안 집계를 차단합니다. 이 프로토콜은이 시점에서 일시 정지 및 집계는 4 ℃에서 수평 자이 러 토리 로커에 일정한 교반, O / N을 차단 될 수 있습니다. 전술 한 바와 같이 PBSFT를 대기음 (섹션 4. 1. 4 참조)과 낮은 속도로 설정 궤도 흔드는에 4 ° C에서 PBSFT O / N에 희석 필요한 일차 항체 500 μL와 집계를 품어. 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름 커버. 차 항체 보육 일차 항체 용액을 흡인하고 다음과 같이하여 (4 ℃에서) 1 mL로 세척한다 PBSFT : 회 5 분간; 세 번 15 분 동안; 1 시간 동안 4-7 번. 4 ° C에서 낮은 속도로 설정 궤도 로커의 각 세척 단계를 수행합니다. 참고 : 칠이 사용하는 매체 이전에 씻는다. 이 단편을 집계을 일으킬 수있는 얼음에 세척을 수행하지 마십시오. 최종 세척 매체를 기음과 수평 자이 러 토리 로커에 어둠 속에서 4 ° C에서 500 μL PBSFT의 O / N에서 필요한 이차 항체와 집계를 품어. 필요한 경우 같은 헥스로 핵 얼룩을 추가합니다. 공 초점 축소 복사하여 설치 및 이미지 4 ° C PBSFT과 4 절 1. 4에 설명 된대로 집계를 씻으십시오. 최종 세척 후, 1 ml의 PBS가 다음의 방식으로 0.2 % FBS 및 트리톤 X-100 (PBT)를 포함하여 응집체 린스 : 회 5 분간; 15 분 동안 세 번. 세척을 수행실온에서 궤도 로커에 빛으로부터 보호. 글리세롤 용액 1 : PBT (1 mL)을 7 초, 30 분 인큐베이션 하였다 : 3 용액 1과 어둠 속에서 30 분 동안 전술 한 바와 같은 매체 대기음 (제 4 1. 4) 및 부화 글리세롤 : PBT (1 mL)을 첨가 하였다. 참고 : 회전을 사용하여 4 ° C에서 글리세롤과 PBT 솔루션을 섞는다. 최종 글리세롤을 대기음 : PBT 솔루션과 매체 (24)를 장착 한 ㎖로 대체합니다. 이 프로토콜은 (일시 정지하는 경우, 파라핀 필름 우물​​을 봉인하고 4 ℃에서 염색 우물을 저장) 이전에 설치에이 시점에서 일시 정지 할 수있다. 컷 P20 팁 (그림 2) 17 μL 방울에서 그들을 피펫 팅에 의해 현미경 슬라이드에 집계를 탑재합니다. 스페이서를 생성하고 슬라이드의 양 끝을 연결하는 다시 자체에 네 번 양면 테이프를 접습니다. (그림 2)이 스페이서에 따라 상단 커버 슬립 (22mm X 60mm)를 놓습니다. 주 : 절단 팁은 필수적이다샘플 손상되지 않도록,이 단계에서 사용 하였다. 스페이서는 집계를 분쇄 커버 슬립을 방지 할 수 있습니다. 골재가 장착되면, 프로토콜을 사용하는 공 초점 현미경을 사용하여 화상 샘플 이전에 설명 19,21,24,25. 일단 현미경에 배치, 집계가 장착 매체 내에 정착 할 수 있도록 몇 분 동안 무대에 평온 슬라이드를 둡니다.