Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
Die Fähigkeit zur Stammzellmutationen zu messen, ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um in einer kritischen Zellpopulation zu quantifizieren, ob und in welchem Umfang kann eine chemische Mutationen, die möglicherweise zu Krebs führen zu induzieren. Die Verwendung eines enzymatischen Assays zur Stammzellmutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Gens zu quantifizieren wurde bereits berichtet. 1 Dieses Verfahren erfordert die Herstellung von Gefrierschnitten und Inkubation des geschnittenen Gewebes mit einem Reaktionsgemisch, das ein ergibt blaue Farbe, wenn die Zellen produzieren funktionelle Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Enzym. Wenn nicht, werden die Zellen erscheinen weißlich. Haben wir die Reaktionsmischung unter Verwendung optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT) Medium anstelle von Polyvinylalkohol modifiziert. Dies erleichtert die pH-Messung erhöht Solubilisierung der G6PD Färbungskomponenten und schränkt die Diffusion der G6PD-Enzym. Um zu demonstrieren, dass eine Mutation aufgetreten ist in einer Stammzelle muss der gesamte Krypta G6PD enzymatische fehltAktivität. Nur wenn eine Stammzelle birgt eine phänotypische G6PD Mutation wird die gesamte Nachkommenschaft in der Krypta fehlt G6PD enzymatische Aktivität. Um Krypten mit einer Stammzelle Mutation zu identifizieren, wurden vier aufeinander folgenden benachbarten Gefrierschnitten (Stufe A) bei 7 & mgr; m Dicke geschnitten. Dieser Ansatz zur Herstellung von benachbarten Schnitten bietet Konformation, die eine Krypta wurde vollständig mutiert, da dieselbe mutierte Krypta in benachbarten Abschnitten beachten. Objektträger mit Gewebeproben, die mehr als 50 & mgr; m getrennt waren bereit waren, insgesamt> 10 4 Krypten pro Maus zu bewerten. Die Mutationsfrequenz ist die Anzahl der beobachteten mutiert (weiß) Krypten durch die Anzahl der Wildtyp (blau) Krypten in einer Behandlungsgruppe ÷.
Introduction
Darmkrebs ist gedacht, um die Exposition gegenüber Umweltfaktoren und Nahrungskomponenten, die DNA schädigen kann es sich um und produzieren Aktivieren somatische Mutationen in Onkogenen (zB ß-Catenin) oder inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressor-Gene (zB APC). Es wird angenommen, dass diese kritische Mutationen in colonic Stammzellen vorkommen. Aufgrund der einzigartigen Architektur der Krypta Kolonepithel, ist es möglich, Stammzellmutationen im Dickdarm nach dem Belichten Tiere Chemikalien Coloncarzinogenese zu bemessen. Mehrere X-chromosomal-Enzyme können als Indikatoren für die Mutationen, die in Stammzellen auftreten dienen, wie die Mutationen wird in allen Zellen in einer Krypta vorhanden sein.
Bisher wurde ein Verfahren veröffentlicht demonstriert, dass Chemikalien, die Dickdarmtumoren in Mäusen zu induzieren ebenfalls erzeugt somatischer Stammzellen Mutationen in den Dickdarm über die Analyse von Mutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Gens. 1-3Das Verfahren quantifiziert die Häufigkeit von Zufalls somatische Mutationen in Kolon-Stammzellen ohne Selektionsdruck. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung von nicht fixierten gefrorenen Doppelpunkt Schnitte von behandelten und Kontrollmäusen und die Identifikation der Krypten frei von Zellen, die funktionelle G6PD-Aktivität zu erzeugen. Diese mutierten Krypten, die weiß erscheinen, zeigen an, dass die Mutation trat bei einer Stammzelle, die zu Nachkommen gab auch beherbergt eine mutierte G6PD-Gen. Im Enzymassay kann G6PD defiziente Mutante Krypten nicht oxidiert Glucose-6-phosphat, die zur Reduktion von Nitro-Blau-Tetrazolium (NBT) erforderlich ist. Wenn G6PD Enzym ist funktionell, wird die NBT in der Färbemischung zu unlöslichem Formazan reduziert und ausfällt, Speichern am Ort des Enzyms und "Schleierbildung" Zellen blau. Zellen, die G6PD Mutanten bleiben weißlichen, im Gegensatz zu blau gefärbte Wildtyp Krypten. Bei dieser Methode wird Mutationen, die eine "null" Phänotyp haben. Weil enEnzyme wie G6PD kann aus den Zellen an einer unfixierten Gewebeschnitt, wenn die Abschnitte in einer wässrigen Lösung platziert diffundieren, ist es erforderlich, das Enzym in den Gewebeabschnitten zu analysierende stabilisieren. 4 die Stabilisierung des Enzyms in der Gewebe darf nicht mit Diffusion kleiner Moleküle Reagenz für G6PD enzymatische Reaktion notwendig stören.
Wir haben eine Reihe von signifikanten Änderungen des ursprünglichen Verfahrens hergestellt. Das Medium für die kritische enzymatische Färbung wurde von Polyvinylalkohol zu optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT), die pH-Steuerung und Solubilisierung der im Assay verwendeten Komponenten ermöglicht geändert. Die Färbung wird durchgeführt unter Verwendung von 0,4 – 0,5 ml Vertiefungen der Stahlscheiben hergestellt, so dass jede Gewebeabschnitt empfangen das gleiche Volumen an G6PD Reaktionsgemisches. Es wurde ein Verfahren entwickelt, um die Anzahl der Krypten in einem abgebildeten Abschnitt, der einen großen Abtastung des Colongewebe bietet, ohne schätzenmanuell zählen,> 10 5 Krypten pro Doppelpunkt. Die Analyse von angrenzenden 7 um Gewebeschnitte ergibt Visualisierung einer Mutante Krypta auf mehr als eine Folie, die so Flecken Artefakte reduziert. Diese Veränderungen stellen das Verfahren effizienter und reproduzierbar.
Nach dem geänderten Protokoll haben wir die Mutationsfrequenz in colonic Stammzellen nach der Belichtung von C57BL / 6-Mäusen zu Azoxymethan, einem bekannten Karzinogen colon in Nagetieren quantifiziert. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
Oft die genotoxische Wirkung einer Verbindung wird durch ihre Fähigkeit, zu modifizieren DNA bestimmt. Dies wird normalerweise durch Isolieren der Gewebe und Messen der globalen Ebene der DNA-Addukte erfolgt. AOM wäre dies die Quantifizierung O 6 -Methylguanin-Addukte in den Dickdarm. Unter Verwendung dieses Ansatzes Informationen zu Schäden innerhalb bestimmter Zelltypen, wie in der Stammzellnische wird verloren. Darüber hinaus ist ein DNA-Addukt nicht das gleiche wie eine Mutation, da nur ein kleiner Te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
