Methoden om de regulerende rol van kleine RNA's en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em> Plasmodium falciparum</em

Malaria wordt veroorzaakt door apicomplexa parasieten van het geslacht Plasmodium, is de meest voorkomende menselijke parasitaire ziekte, wereldwijd infecteren ongeveer 200 miljoen mensen per jaar en het veroorzaken van zo'n 600.000 doden ^1. Van de vijf Plasmodium soorten die de mens infecteren, het meest relevant zijn voor de menselijke ziekte P. falciparum en P. vivax, vanwege hun brede verdelingen en wat ernstige malaria complicaties. De levenscyclus van de malariaparasiet vereist infectie van zowel muggen en mens. Wanneer een geïnfecteerde mug bijt een mens, de parasieten reizen via de bloedbaan naar de lever, waarbij een eerste ronde van de replicatie plaatsvindt. Na merozoites breuk van de gastheer hepatocyten, die ze infecteren nabijgelegen rode bloedcellen, het initiëren of aseksuele en seksuele replicatie. De aseksuele fase van replicatie, die 48 uur duurt in P. falciparum, is de focus van dit onderzoek, aangezien het zowel de bron van de meeste malaria symptomen en gemakkelijk gerecapituleerd in vitro.

Terwijl een aantal initiatieven voor de volksgezondheid, waaronder verbeterde anti-malaria therapieën, enigszins verminderde de last van malaria wereldwijd, de voortdurende opkomst van resistente parasieten vormt een probleem voor malaria controle-inspanningen. Een gebied waarop nieuwe therapeutische benaderingen kunnen voorstellen is de studie over hoe de verschillende genetische varianten resistentie tegen malaria. In malaria-endemische gebieden, een verscheidenheid aan erythrocytische polymorfismen zijn vrij algemeen ^2,3. Deze mutaties, met sikkelcelziekte zijn misschien de meest prominente, vaak geassocieerd met aanzienlijke weerstand tegen het ontstaan ​​van symptomatische malaria ^4. De onderliggende mechanismen die ze veroorzaken erytrocyten aan malaria-infectie te weerstaan ​​zijn onvolledig begrepen. Geparasiteerde erytrocyten met hemoglobine mutaties zijn onderhevig aan verbeterde fagocytose door een betere cellulaire stijfheid en uitdroging, dieis geassocieerd met verminderde invasie van P. Falciparum ^5. De HbC allel ook invloed op eiwitexpressie in de erytrocyten oppervlak en de hermodellering van het cytoskelet, verdere ontwikkeling remmen parasiet ^6,7. Tenslotte P. falciparum groeit slecht binnen homozygote sikkel (HbSS) erytrocyten ^8,9 in vitro, wat suggereert intrinsieke erythrocytaire factoren van malaria weerstand. Hoewel al deze mechanismen blijken een rol te spelen, zij niet volledig de mechanismen achter sikkelcel resistentie tegen malaria leggen.

Een mogelijke set erythrocytische factoren die slecht blijven begrepen is het grote zwembad van miRNA aanwezig is in rijpe erytrocyten. MicroRNAs zijn kleine niet-coderende RNA's 19-25 nt in grootte, die translatie en / of stabiliteit van target mRNAs bemiddelen door basenparing binnen de 3 'UTR. Ze zijn betrokken bij de controle van zoogdier immuunresponsen, zoals de onderdrukking of virusreplicatie ^10, en werden naar resistentie tegen virussen in planten Zij hebben ook aangetoond dat verschillende erythrocytische processen, waaronder erytropoëse ^11,12 en ijzerstofwisseling ¹³ reguleren. Eerdere studies die een rijke en gevarieerde bevolking van erythrocytische miRNAs, waarvan de expressie is dramatisch veranderd in HBSS erytrocyten ^14,15. Sinds rijpe erytrocyten gebrek actieve transcriptie en translatie, de functionele rol van deze erytrocyten miRNAs blijft onduidelijk. Zo belangrijk materiaal uitwisseling plaatsvindt tussen de gastheercel en P. falciparum tijdens de intraerythrocytic ontwikkelings cyclus (IDC) ^16, werd gespeculeerd dat de veranderde miRNA profiel binnen HbS erytrocyten direct kunnen bijdragen aan de cel-intrinsieke malaria weerstand.

Deze studies leidde uiteindelijk tot de ontwikkeling van een pijpleiding voor het isoleren, identificeren en functioneel bestuderen van de rol van menselijke miRNA in de malaria parasiet, P. falciparum, die aangaf dat de gastheer / menselijke miRNAs uiteindelijk covalent zekering en vervolgens translationeel onderdrukken parasiet mRNA-transcripten ^17. Dit verschaft een voorbeeld van het eerste cross-species chimere transcripten gevormd door trans-splicing en impliceert dat miRNA-mRNA-fusie kan optreden in andere soorten, waaronder andere parasieten. Alle trypanosoom mRNA trans-splicing met een splice-leader (SL) de scheiding van polycistronische ¹⁸ transcripten reguleren. Aangezien P. falciparum ontbreekt orthologen voor Dicer / Ago ^19,20, is het mogelijk dat erytrocyten miRNAs kapen vergelijkbare SL machines in P. falciparum te integreren in target genen. Recente studies in P. falciparum in feite gaf de aanwezigheid van 5 'splice leadersequenties ^21. Deze studie beschrijft de methodes die tot de ontdekking van humane parasieten miRNA-mRNA fusietranscripten, zowel transcriptoom en translanale regelgeving technieken. De algemene doelstelling van deze methoden om de effecten van kleine RNAs in genregulatie, fenotypen en vertaling potentieel van P. onderzoeken falciparum transcripties.

De initiële identificatie van humane parasieten chimere transcripten aangevoerd gebruik van RNA analysetechnieken, zoals real-time PCR, sequencing en transcriptoom EST bibliotheek vangen, die zowel totaal en kleine RNAs, in plaats van technieken die op geïsoleerde kleine RNA inbegrepen. Isoleren alle RNA samen in een grote pool, in plaats van afzonderlijk het mogelijk gemaakt zowel translocatie menselijke kleine RNA in de parasiet en de aanwezigheid van deze kleine RNA-sequenties als deel van een grotere sequentie. Dit vereist dan een analyse van de translatietoestand van deze fusie-mRNA's om de functionele consequenties van deze fusies bepalen.

Terwijl de uitgebreide inspanningen op het karakteriseren van de parasiet genoom eend transcriptome hebben toegevoegd aan het begrip van de parasiet biologie ^22-25, veel minder bekend over de translationele regulering van het mRNA transcriptoom over de levenscyclus van P. ²⁶ falciparum. Deze beperkte begrip van proteoom de parasiet heeft zowel begrip van de biologie van de parasiet en de mogelijkheid om nieuwe targets te identificeren voor de volgende generatie van anti-malaria therapeutische gehinderd. Deze kloof in het begrijpen van cellulaire biologie van de parasiet is grotendeels te wijten aan het gebrek aan passende technieken bleef translationeel regelgeving P. onderzoeken falciparum. Een recent artikel beschreef het gebruik van ribosomale footprinting van P. falciparum de wereldwijde vertaalstatus ²¹ te bepalen. Een gevestigde meting van translatie van transcripten mogelijk is het aantal geassocieerde ribosomen bepaald polysoomdisplays profilering. Echter, wanneer deze techniek wordt toegepast voor P. falciparum </ em>, het is niet in staat om de meeste polysomen herstellen en vangt overwegend monosomes. Onlangs hebben diverse groepen ^27,28 P. geoptimaliseerd falciparum polysoom technieken door lyseren van de erytrocyten en parasiet gelijktijdig aan de polysomen behouden en te karakteriseren de ribosomale bezetting en translationele potentieel van deze malariaparasieten tijdens hun ongeslachtelijke ontwikkeling in gastheer rode bloedcellen ^28.

Tezamen zijn deze werkwijzen tonen dat de waargenomen fusie van menselijke miRNA parasitaire mRNAs moduleert parasiet eiwittranslatie van die fusie-mRNA, waarbij werd aangetoond met eerder beschreven werkwijzen ²⁷ en is een belangrijke determinant van malaria resistentie in HbAS en HbSS erytrocyten ^17. Deze methoden zou nuttig zijn in elk systeem op zoek naar RNA splicing gebeurtenissen identificeren en functioneel te verkennen, of die fusie RNA's zijn binnen P. falciparum of andere eukaryotische systemen.