浸透圧を使用して皮下アンジオテンシンII注入は、マウスで誘導大動脈瘤パンプス

倫理の声明：マウスの​​研究では、ケンタッキー州制度動物実験委員会（：2006-0009 IACUCプロトコル番号）の大学の承認を得て行われています。マウスは、ケタミン（〜210ミリグラム/ kg）およびキシラジンの過剰摂取カクテル（〜30ミリグラム/キログラム）を使用して、終了時に安楽死させます。 AngII量の1計算注：このプロトコルは、4男性のLDL受容体に4週間のAngII（千NG / kg /分）の注入の例を使用しています – / – マウスは、飽和脂肪に富んだ食餌を与え。 注入のために必要なのAngIIの量を計算する前にマウスを研究秤量します。 実験に必要なのAngIIの質量を計算するためのテンプレート（ 表1）を使用します。テンプレートのステップ4の「ポンプ速度」としてポンプの指示に示されている「平均ポンプ速度」を使用してください。手動で5、およびステップ6 – – テンプレートでは、レコードが1〜ステップ10は自動的に計算されます。 テンプレートでは、と仮定マウスは、4週間のAngII千NG / kg /分の注入時の体重1gを得ることができます。 注：各マウスは、マウス株および食事のような多くの変数に依存する非常に異なる体重増加を有していてもよいです。私たちは日常的にこれまでの研究から、私たち自身の経験に基づいて、「0」か「1グラム」を使用します。 各ポンプは、約250マイクロリットルを必要とするため、各マウスのためのAngII液300μlの総容量を計算します。 AngIIの2.解散ストアは、-20℃でのAngIIバイアルを凍結乾燥しました。開口部の前にRTへのAngIIバイアルを平衡化。 滅菌プラスチックチューブに計算された質量のAngII（ 表1に示すように7.3 mg）を秤量します。 注：のAngIIの水溶液をガラスに結合するための強い親和性を有するため、メルクインデックスごとに、溶解用のガラス管を使用しないでください。 滅菌生理食塩水の計算量を追加します（1200μ凍結乾燥のAngII、キャップを含むプラスチックチューブにL）、溶液が透明になるまで反転により完全に混合。 ラベルマウス番号＃1、＃2、＃3、およびキャップを有する個々の滅菌プラスチックチューブの＃4（0.5〜1.5ミリリットル）。ステップ1.2および表1で計算される体重に基づいて各マウスについて層状フード下のAngIIの溶液を調製します。 例えば、チューブ＃1に、ピペット3.6μlの滅菌生理食塩水、その後、296.4μLのAngII液、ゆっくり上下にピペッティングすることによって十分に混合します。 （;滅菌4ミリリットル）キャップ付きプラスチックチューブのラベルにマウス番号。これらは、ステップ3.13に記載されるようにポンプをインキュベートするために使用されます。 3.浸透圧ポンプの充填ポンプの本体と流量調節（ 図1）：2つの部分にポンプを取得します。各ボックスは、個別包装されている10ポンプ本体とフローモデレーターを持っています。ロット番号を記録します。 注：常に着用手袋は、ポンプの外部ケーシングに手から転送された油は、悪の機能をポンプに影響しますので。インプラントからの感染の危険性を回避するために、滅菌手袋、ガーゼ、チューブ、充填針を使用し、ポンプを準備するためにボートを量ります。 これらは一度開け格納することができないように、研究のために必要なポンプ本体とフローモデレーターの数のみを開きます。 10以上のポンプが必要な場合は、別のロット番号からのポンプは異なる平均充填量とポンプ速度を持っているので、ポンプのロット番号は、一つの研究のために同じであることを確認してください。 （本体とモデレータをフローの両方を含む）の各ポンプを計量し、小数点以下4桁に重みを注意してください（例えば、マウス＃の1.1443グラム1）。テンプレート（ 表1）に「ポンプの重量は空」と呼ばれるこの量は、充填率を算出するために使用されます。 1 ccの滅菌注射器にポンプ充填針を取り付け、慎重に適切からのAngII溶液で注射器を埋めます番号のプラスチックチューブ。これは、シリンジ内に空気を吸引しないようにすることが重要です。 針が下方に位置している注射器から慎重にすべての気泡を除去します。ポンプ内の気泡の導入を防止するために、この位置に針/注射器を保管してください。 静かにポンプ本体内に充填針を挿入します。ポンプ内に針の先端を進めます。ポンプの底にしっかりと針の先端を休まないでください。 AngIIの溶液を用いてポンプを埋めるために、ゆっくりとシリンジプランジャーを押してください。ポンプ内部の暗い影が充填レベルを示しています。充填量は指示に従って、約246μlです。 ポンプを充填停止し、流体のビーズがポンプの外に上昇すると、慎重にとすぐに針を取り除きます。 隙間が流量調節のヘッドとポンプ本体の上面（ 図1）の間に見られなくなるまで、ポンプ本体の上部の穴を介してポンプへの流量調節を挿入します。 moderatの挿入またはポンプ本体に流量調節の開口部から一部の流体漏れにつながります。慎重にモデレータの配置中に漏洩した可能性があるすべての余分な油を吸い取ります。 満たされたポンプを計量。テンプレートに「充填ポンプ重量」の重量を記録します。 充填率（％）=（ "満たされた「ポンプ重量 – 「空」）を計算すると、千/ボリューム×100を埋める意味xは。 充填率が等しいか100％より大きくあるべきで、理想的には、表1に示すように充填率算出します。補充ポンプ充填率が<95％（気泡がポンプ内に存在してもよいことが暗示される）場合。 モデレータヘッドを上に向けてラベル4ミリリットルチューブ（ステップ2.5）に充填ポンプを配置します。ポンプをカバーするために滅菌生理食塩水の十分な量を追加します。移植までの生理食塩水管にポンプを保管してください。 37ºCインキュベーター内チューブを置きます。インキュベートは、部分的なプライミングを可能にした後、マウスに移植するために、O / N（少なくとも12時間）ポンプ。パンプAngIIのINGは、マウスが手術からの事前のAngII注入の間に生じるいかなる潜在的なストレスに回復することができ、移植後約24時間を、開始します。 ポンプ注入の4準備オートクレーブ（重力モード、ドライサイクル、15分）ガーゼ、綿棒やハサミ、止血剤、鉗子、ステープルを含む外科用ツール、およびステープラー少なくとも1日手術前に。 処置室では、イソフルランを使用して麻酔用気化器を準備します。層流フード内で無菌ドレープを開き、およびイソフルラン麻酔のためのノーズコーンを配置します。層流フード内でベタジン、70％エタノール、滅菌水、ビーズ殺菌、防腐手でこする、綿棒、ガーゼ、充填ポンプを配置します。 ドン・マスクとガウンは、その後、清潔な手で層流フード内で外側ドレープを開きます。滅菌手袋の上に置き、滅菌内部パックを開きます。 ポンプ注入の5の外科的処置誘導チャムにマウスを置きます2％ – 1.5の流速でイソフルランの流入と​​BER。横臥した後、3分 – 追加の2のためのマウスを監視します。左または右の肩の上に、四半期ほどの大きさの領域を剃ります。 イソフルラン流出（ 図2A）に接続されたコーンと同一平面の鼻で、層状フード内でマウスを置きます。外科医の利き手に向かってマウスの頭を置きます。麻酔下ながら乾燥を防止するために、マウスの目に獣医軟膏を使用してください。マウスは手術前の痛みの刺激に対する応答を持っていないことを確認してください。例えば、ペダル応答は痛みのための良好な指標です。 スワブ、70％エタノールで3ワイプ続いベタジンで剃毛面積を拭きます。ドンまたは滅菌手袋を変更します。 前脚の肩甲骨の上に耳の後ろ〜1cmの切開を作るために、外科用メスを使用してください。この切開は、尾に垂直でなければなりません。皮膚のみではなく、下にある組織を切るように注意してください。 ホールドFORC片手でのEPSは切開を開き、止血剤（ 図2B）を使用して、皮膚の下に皮下トンネルを作るためにもう一方の手を使用しています。 テールに向かって止血先端を進める、とポンプ用のポケットを作成します。これは慎重に袋を開くために、皮膚の下に止血剤の顎を開くことによって達成されます。切開から止血剤を撤回。 マウス（ 図2C）の後方に配置さモデレータヘッドを切開部にポンプを挿入します。そっとポケットに完全にポンプを押してください。無緊張や皮膚の伸縮に傷を閉鎖するのに十分な空き領域が必要です。 ポンプが挿入された後、しっかりので、エッジが会う矯正、切開部の両側を挟まれ、（ 図2D）を閉じるように1または2創傷クリップを配置します。傷の完全な閉鎖があることを確認するために切開部位を点検し、ポンプは、サイト上で直接押しされていないこと。 局所リドカインクリームを適用しますノーズコーンからきれいな綿のswab.Removeマウス（4重量/重量％）であり、それが意識を取り戻すまで加熱パッドの上に置きます。回収した後、マウスをそのケージに戻しています。 マウスとの間に10秒間ビーズ滅菌器に手術器具を配置します。楽器が使用する前に冷却してください。マウスの間消毒手でこするときれいな手袋。完全な回復が達成されるまで、すべてのマウスを監視します。 密接に手術後のマウスを監視します。マウスが苦痛、脱水または見かけの体重減少の兆候を示している場合 – （0.3ミリリットル0.2）を皮下滅菌生理食塩水のボーラスを注入します。最初の10日の間に少なくとも一日二回、マウスを観察し、その後少なくとも一度毎日。任意のマウスは、AngIIの輸液中に死亡場合は、直ちに剖検を実行します。手術後14日 – 7との間に創傷クリップを削除します。 6.収穫、定着、クリーニング、および大動脈のイメージング OPEをカットし、腹側マウスの胸部と腹部の空洞を切り開いnは右心房、大動脈に血液を除去した後、大動脈27を収穫するために心臓の左心室を介して生理食塩水で灌流。 48時間27から24のために4％パラホルムアルデヒドまたは10％中性緩衝ホルマリン少なくとも3 mlを含有するプラスチックチューブで採取した大動脈を配置します。 慎重に外膜組織を削除します。ピンと黒のワックスのピン大動脈。同じ倍率で大動脈の画像を取得します。 図3に示すように、キャリブレーション用の各画像内の定規を含めます。 大動脈の7.エン面イメージング大動脈弓の外側と内側の曲率を通って長手方向に開いて大動脈を切断し、腕頭、左頸動脈、左鎖骨下動脈などのオープン主要な枝を切りました。外側の外膜は、黒のワックスに隣接して敷設とフラットピン大動脈。 同じ倍率で大動脈の内膜表面の顔写真エン取得。ショーのように、キャリブレーション用の各画像内の支配者を含めます図4中のn。