Грызунов Мозг Микроинъекция по изучению молекулярных субстратов мотивированное поведение
Summary
Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Abstract
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Introduction
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедура, представленная здесь является эффективным средством для производства микроинъекции канюли и микроинъекторы, которые помогут в выяснении молекулярных субстратов мотивированного поведения. Этот метод имеет ряд преимуществ. Во-первых, производство собственных имплантатов и микроинъекторы, новые экспериментальные параметры могут быть быстро оптимизированы, то есть, никто не нужно ждать на заказ компонентов, чтобы прибыть. Во-вторых, из-за малого диаметра канюли, более канюли могут быть одновременно имплантированные. Это сокращает требуемое время хирургического, что может улучшить выживаемость, а также позволяет использовать несколько имплантатов на одно животное. В-третьих, программное обеспечение, используемое для управления рабочих камерах легко вмещает прогрессивные графики соотношение так фиксированное соотношение парадигма может быть быстро превращается в прогрессивный соотношение парадигмы простым применением список событий перехода параметр, который содержит нужную подкрепления.
Бытьшироко полезным, общий порядок микроинъекции был представлен, который должен быть широко применимы для микроинъекции почти любой реагента в настоящее время. Следовательно, мы ожидаем, что эта техника будет по-прежнему подобного высокой полезности в будущем с небольшой модификацией. Изменяя только несколько переменных, этот подход может быть применен к широкому ряду реагентов. Параметры, которые наиболее часто манипулировать включают длину, что microinjector выступает из канюли, объем инъекции, и скорость инъекции. Например, может быть желательным инжектор, чтобы выступать дальше от наконечником канюли, чтобы избежать глиальных шрам, который, как правило, формируется вокруг хронических имплантатов. Кроме того, можно пожелать, чтобы придать больший объем. Для полосатого тела вируса микроинъекций, объем 1 мкл обычно используется и этот объем обычно впрыскивают в течение более длительного периода времени (часто 7 – 10 мин, плюс 3 – 10 мин дополнительного времени диффузии) по сравнению с использованиемд фармакологических реагентов (обычно 0,3 – 0,5 мкл в течение 2 – 3 мин плюс 1 – 3 мин время дополнительного диффузионного). Пользователь должен проконсультироваться литературу и / или эмпирически определить параметры лучше всего подходят для удовлетворения их потребностей. Несмотря на это, успех этой процедуры является критически зависит от 4 переменных: 1) длины канюли, 2) длины microinjector, 3) качество рисунка microinjector распыления и 4) целостность системы перед инъекцией. Потому что микроинъекции расположение зависит от глубины, что microinjector выступает из канюли, крайне важно, чтобы обе канюли (Шаг 1.2.8) и длина microinjector (после изгиба, шаг 2.2.1) оба точно известно и равномерное между всеми субъектами , Это может быть легко управляется легко отвергая любые осуществить это не требуемая длина на заключительном повторного измерения. Кроме того, место впрыска может быть предсказано, только если оно происходит непосредственно под направляющей канюли. Таким образом, любой microinjector, что ланьы не распыляйте длинный, тонкий поток на тестирование (Шаги 2.4.6) должны быть отклонены. Инъекция качество также связано с целостности системы перед инъекцией. Если после выдачи всю воду из форсунки (перед заполнением с реагентом) множество точек наблюдаются на лабораторном стереть, а затем утечка должна быть устранена (Примечание на Шаге 2.4.8). Кроме того, если пузырь (Шаг 2.4.9), который отделяет препарат из воды в трубке PE20 не один, один пузырь (после заполнения microinjector с реагентом), а затем инжектор Частично забит. Это может засорить либо предотвратить, либо отвлечь инъекции. Это тоже может быть легко исправлено (Обратите внимание на этапе 2.4.8).
Если один желает microinject в то время как животное в стереотаксической рамы имеются три альтернативы. Во-первых, можно было бы увеличить длину microinjector воротника таким образом, что он может быть прочно удерживается стереотаксической манипулятора, а также продлить достаточно далеко, чтобы позволить соединение с PE20 трубок. Во-вторых, нае могли временно внедрить канюлю и использовать стандартный microinjector представленные здесь. В-третьих, можно использовать обращается и полированные стеклянные пипетки. 16,17
Существенным недостатком процедуры, представленной здесь является то, что лучше всего проводить в хорошо обработанных крыс, которые знакомы с процедурой. Крысы, используемые для данных, описанных в разделе результатов не требуется никаких специальных процедур обработки, потому что тот же следователь обрабатываются крыс ежедневно в течение 2 месяцев. Это включало ежедневное наблюдение и манипуляции с хирургической имплантации в течение по меньшей мере 2 недель. Тем не менее, крысы, могут быть быстро привыкли рядом методов, которые используются для до предварительно импульса анализа ингибирования, которая может зависеть от напряжения. Эти специальные методы привыкания были хорошо описаны ранее. 43 В дополнение к этим процедурам, желательно, чтобы крысы привыкли быть в порядке микроинъекции, где укороченные микроинъекторы используются дукольцо "фиктивных" инъекции. Во время этих фиктивных инъекций, важно, что microinjector не выступают в ткани для того, чтобы ограничить повреждение тканей. В не Иными словами, microinjector должны быть согнуты не более 14 мм. Таким образом, тщательное привыкание требуется для оптимальной реализации этого метода можно рассматривать как ограничение.
В то время как несколько поведенческих парадигм существуют, чтобы измерить мотивацию, прогрессивный коэффициент обычно используется для количественной оценки усилий, что субъект готов оказать получить подкрепления. Прогрессивная отношение парадигма производит измерение, известное как точки останова, которая часто определяется как максимальное количество рычагов прессов в последний завершенный отношение;., Т. Е, максимальная отвечать, что породил подкрепления 21 Прогрессивная отношение чувствительны к подкрепления величину. Например, выше, кокаин (или сахарозы) дозы вызывают более высокий останова и нижнюю кокаин (или сахарозы) дозы дают более низкую breakpoint. 21,22 Таким образом, точка останова является регулярно использовать прокси-сервер для мотивации и / или армирующего эффективности. 21,23-26 Поскольку намерение останова, чтобы определить, когда животное перестает отвечать на запросы, важным параметром прогрессивным отношением парадигмы Длина сессия. Конечные длины сессия может поставить ложный крышку останова значений, и это может быть усилено предварительной обработки, что аномально уменьшить скорость самоуправления или иного увеличение после армирования паузы. Это тупик можно преодолеть любое количество подходов;.. Например, сессий, что прекратить, когда животное удерживается отвечать некоторым кратного среднего интервала между инфузии 44 Более широко применяется вариант этого подхода заключается в прекращении сессий раз отвечая имеет был удержан некоторой эмпирически определенной величины, которая проводится постоянная по предметам. Мы предоставили метод применять этот подход в шаге 4.4.9.11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Materials
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. . Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. . Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
