Kvantifisering av cytosolisk vs. vacuolar<em> Salmonella</em> I Primær Makrofager av Differential Permeabilization

Intracellulære bakterielle patogener replikere enten direkte i vertscellen cytosol, eller i spesialiserte vacuolar kamrene ^1. Under den første fasen av infeksjonen fleste patogener blir internalisert enten ved fagocytose av spesialiserte celler (for eksempel makrofager), eller ved aktivt å fremme sin egen opptak i ikke-fagocyttiske celler. I fagocytiske celler, phagosome normalt sikringer med lysosomer å danne en nedbrytende rommet, hvor fagocytterte partiklene er fordøyd. Specialized cytosolic bakterier, for eksempel Francis novicida eller Shigella flexneri, rømme phagosomal degradering ved å fremkalle bruddet i phagosome og deretter flykte inn i cytosol ^2,3. Dette krever virulens-forbundet mekanisme som Francis patogenitet Island (FPI) eller Shigella flexneri T3SS, som injiserer effektor proteiner som fremmer vacuolar brudd ^2-4. Vertscellen cytosol egenskaperen rekke bevarte mønstergjenkjenning reseptorer som normalt gjenkjenne tilstedeværelsen av patogener og induserer medfødte immunsignale ^5. I tillegg xenophagy, kan en antimikrobiell form av autophagy nedbryte bakterier som kommer inn i cytosol. Cytosolic bakterier er normalt godt tilpasset sløv eller omgå disse svarene ved hjelp av ulike strategier. For eksempel endrer Francis sine LPS unngå vert anerkjennelse og Shigella hindrer autofagi rekruttering hjelp utskilte effektor proteiner ^6,7.

En annen strategi for å unnslippe lysosomal degradering er ansatt av modellen vacuolar patogen Salmonella ente serovar Typhimurium, deretter kalt Salmonella typhimurium. Salmonella bruker en T3SS å injisere effektorer som renovere den innledende phagosome inn sin intracellulære nisje, Salmonella-holdig vakuole (SCV) ^8,9. Kontinuerlig manipulering av verts trasé erer nødvendig for å opprettholde denne vakuole ved å rekruttere lipider og andre næringsstoffer til vakuolen. Faktisk en SIFA mutant av Salmonella ikke klarer å opprettholde vacuolar stabilitet, og går inn i cytosol av vertsceller i løpet av timer etter infeksjon, noe som resulterer i aktivering av medfødte immun trasé og autophagy rekruttering ^8. Vacuolar rømning av Salmonella varierer avhengig av celletype som er studier, og flere rapporter har vist at i epitelceller og med WT Salmonella kan unnslippe SCV og hyperreplicate i cytosol ^10. Nylige rapporter viser at medfødte immun påvisning av patogener vacuolar er også avhengig av evnen til verten for å gjenkjenne og destabilisere patogen-holdige vakuoler (PCVs) ^11-14.

Gitt at både verten eller bakterier genotype kan påvirke fordelingen av intracellulære bakterier mellom vacuolar og cytosolisk rommet, er det nødvendig å kvantifisere antallet vacuolar vs.cytosolic bakterier. Siden, i de fleste forsøksoppsett vertsceller infiseres med mer enn en bakterie, og deretter kan havnen flere bakterier i forskjellige subcellulære avdelinger, er en teknikk som gjør det mulig nødvendig kvantifisering av nivået av enkelt bakterier. Differential permeabilization (også kjent som phagosomal beskyttelsestest) gir dette vedtaket ^2,4,10,12. Analysen er basert på selektiv permeabilization av vertscellen plasmamembranen med vaskemiddel digitonin, noe som etterlater vacuolar membraner intakt og tillater således selektiv farging av cytosoliske bakterier med antistoffer. Her gir vi to protokoller for kvantifisering av cytosolisk og vacuolar Salmonella typhimurium hjelp differensial permeabilization. Prinsippet for denne fremgangsmåte er beskrevet i Figur 1: benmarg avledede makrofager (BMDMs) er smittet med stasjonær fase mCherry-uttrykkende Salmonella. Stasjonær fase Salmonella trenger to brukes fordi de nedregulere ekspresjon av SPI-en T3SS, hvis virksomhet ellers ville bli gjenkjent av NLRC4 inflammasome og indusere rask celledød (pyroptosis) av BMDMs ^15. Etter infeksjon Cellene vaskes og behandles med 50 ug / ml digitonin i 1 minutt. Celler blir vasket igjen med en gang og inkubert med anti-Salmonella-antistoffer koblet til FITC for å markere bakterier med tilgang til cytosol. Etter et ytterligere vasketrinn ble cellene lyseres og andelen av mCherry + (vacuolar) og FITC + / mCherry + (cytosol) bakterier bestemmes ved hjelp av FACS. Vi rapporterer også en tilpasning av denne metoden som kan benyttes hvis ingen fluorescerende protein-uttrykkende stammer er tilgjengelige (figur 2). Ytterligere trinn er innført etter at FITC merking i hvilke celler er faste og fullstendig permeabilisert. Deretter alle bakterier er farget med anti Salmonella antistoffer og tilhørende sekundære antistoffer. Detection deretter gjøres ved mikroskopi i stedet for FACS analyse.