Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em> Salmonella</em> In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

Intracellulaire bacteriële pathogenen repliceren rechtstreeks in de gastheercel cytosol of in gespecialiseerde vacuolaire compartimenten ^1. Tijdens de beginfase van de infectie meest pathogenen te geïnternaliseerd hetzij fagocytose door gespecialiseerde cellen (bijvoorbeeld macrofagen) of actief bevorderen hun opname in niet-fagocytaire cellen. In fagocytische cellen, de fagosoom normaal gen met lysosomen een degradatieve compartiment, waarbij de gefagocyteerde deeltjes gedigereerd vormen. Gespecialiseerde cytosolische bacteriën, zoals Francisella novicida of Shigella flexneri, ontsnappen phagosomal afbraak door het induceren van de breuk van de phagosome en vervolgens ontsnappen in de cytosol ^2,3. Dit vereist-virulentie geassocieerd mechanisme zoals de Francisella Pathogeniteit Island (FPI), of de Shigella flexneri T3SS, die effector eiwitten die de vacuole breuk ^2-4 bevorderen injecteert. De gastheercel cytosol functieseen aantal geconserveerde patroonherkenning receptoren die normaal gesproken de aanwezigheid van ziekteverwekkers herkennen en veroorzaken aangeboren immuunsysteem signalering ^5. Bovendien xenophagy, een antimicrobieel vorm van autophagy kan bacteriën die de cytosol voeren degraderen. Cytosolische bacteriën zijn doorgaans goed aangepast aan het bot of te omzeilen deze reacties met behulp van verschillende strategieën. Bijvoorbeeld, Francisella wijzigt haar LPS gastheer erkenning te vermijden en Shigella voorkomt autofagie recruitment met uitgescheiden effector eiwitten ^6,7.

Een andere strategie om lysosomale degradatie ontsnappen is in dienst van het model vacuole pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium, daarna aangeduid als Salmonella typhimurium. Salmonella maakt gebruik van een T3SS aan effectoren dat de eerste phagosome verbouwen in zijn intracellulaire niche te injecteren, de Salmonella bevattende vacuole (SCV) ^8,9. Continue manipulatie van gastheer paden ismoet deze vacuole door het aantrekken lipiden en andere voedingsstoffen naar de vacuole te handhaven. Inderdaad, een Sifa mutant van Salmonella nalaat vacuolaire stabiliteit, en komt in de cytosol gastheercellen binnen enkele uren na infectie, wat resulteert in activering van innate immune paden en autophagy recruitment ^8. Vacuolaire ontsnappen van Salmonella varieert afhankelijk van het celtype dat studies en verschillende rapporten hebben aangetoond dat epitheelcellen zelfs WT Salmonella kunnen de SCV en hyperreplicate ontsnappen in de cytosol ^10. Recente rapporten tonen aan dat aangeboren immuunsysteem detectie vacuolen pathogenen ook afhankelijk van het vermogen van de gastheer herkennen en destabiliseren pathogeen bevattende vacuolen (PCVs) ^11-14.

Aangezien de host of de bacteriën kunnen genotype verdeling van intracellulaire bacteriën tussen de vacuole en cytosolische compartiment beïnvloeden, is het noodzakelijk om het aantal vacuolen vs. kwantificerencytosolische bacteriën. Aangezien in de meeste experimentele opstellingen gastheercellen worden geïnfecteerd met meer dan één bacterie, vervolgens kunnen verschillende bacteriën herbergen in verschillende subcellulaire compartimenten, is een techniek vereist die kwantificering mogelijk maakt op het niveau van afzonderlijke bacteriën. Differential permeabilisatie (ook bekend als bescherming phagosomal test) biedt deze resolutie ^2,4,10,12. De assay is gebaseerd op selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan gastheercel met het detergens digitonine, die vacuolaire membranen wordt afgebroken en maakt daardoor selectieve kleuring van cytosolisch bacteriën antilichamen. Hier hebben we twee protocollen voor het kwantificeren van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium middels differentiële permeabilisatie. Het principe van deze werkwijze wordt beschreven in Figuur 1: beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) worden geïnfecteerd met stationaire fase mCherry-expressie Salmonella. Stationaire fase Salmonella nodig to worden gebruikt omdat ze downregulate de uitdrukking van de SPI-1 T3SS, waarvan de activiteit anders zouden worden erkend door de NLRC4 inflammasoom en veroorzaken een snelle celdood (pyroptosis) van de BMDMs ^15. Na de infectie werden de cellen worden gewassen en behandeld met 50 ug / ml digitonine gedurende 1 minuut. Cellen worden onmiddellijk opnieuw gewassen en geïncubeerd met anti-Salmonella-antilichamen gekoppeld met FITC bacteriën markeren met toegang tot het cytosol. Na een additionele wasstap cellen worden gelyseerd en het percentage mCherry + (vacuole) en FITC + / + mCherry (cytosol) bacteriën wordt bepaald door FACS. We rapporteren ook een aanpassing van deze werkwijze die kan worden gebruikt als er geen fluorescerend eiwit tot expressie stammen zijn (figuur 2). Extra stappen zijn ingevoerd na de FITC labeling waarbij cellen gefixeerd en volledig gepermeabiliseerd. Daarna alle bacteriën worden gekleurd met anti-Salmonella antistoffen en bijbehorende secundaire antilichamen. Deteel gebeurt dan door middel van microscopisch plaats van FACS-analyse.