الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em> السالمونيلا</em> في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization
Summary
We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.
Abstract
يمكن مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تكرار في العصارة الخلوية أو في فجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض المتخصصة (PCVS). للوصول إلى العصارة الخلوية، مثل البكتيريا الشغيلة الفلكسنرية والفرنسيسيلة القتولة تحتاج للحث على تمزق يبلوع. في المقابل، السالمونيلا التيفية الفأرية يتطابق في مقصورة فجوي، والمعروفة باسم السالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV). فشلت المسوخ ولكن بعض من السالمونيلا للحفاظ على سلامة SCV، وبالتالي فهي تطلق في العصارة الخلوية. النسبة المئوية للعصاري خلوي مقابل البكتيريا فجوي على مستوى البكتيريا واحدة يمكن أن يقاس permeabilization التفاضلي، المعروف أيضا باسم فحص يبلوع الحماية. نهج يجعل من استخدام خاصية المنظفات ديجيتونين لربط بشكل انتقائي الكولسترول. منذ غشاء البلازما يحتوي على أكثر الكولسترول من الأغشية الخلوية الأخرى، ديجيتونين يمكن استخدامها لpermeabilize انتقائي غشاء البلازما بينما يترك الخلايا الأغشيةسليمة. وباختصار، بعد العدوى مع الممرض تعبر عن البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال mCherry وغيرها)، وpermeabilized الغشاء البلازمي للخلايا المضيفة مع حضانة قصيرة في ديجيتونين تحتوي على العازلة. ثم يتم غسل الخلايا وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية (بالإضافة إلى fluorophore الاختيار) موجهة ضد البكتيريا الاختيار (مثل مكافحة السالمونيلا -FITC) وغسلها مرة أخرى. إذا تم استخدام البكتيريا تحمل علامات، ويمكن أن يتم خطوة إضافية، والتي هي permeabilized جميع أغشية وجميع البكتيريا ملطخة الضد المقابل. بعد التلوين، نسبة فجوي وعصاري خلوي البكتيريا يمكن أن يكون كميا بواسطة FACS أو المجهري عن طريق عد أحداث مفردة أو مزدوجة إيجابية. نحن هنا تقديم تفاصيل تجريبية لاستخدام هذه التقنية مع بكتيريا السالمونيلا التيفية الفأرية. الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه، على النقيض من فحص آخر، فإنه يوفر الكمي على مستوى bacte واحدريا، واذا ما تم تحليلها بواسطة المجهر توفر العدد الدقيق للعصاري خلوي والبكتيريا فجوي في خلية معينة.
Introduction
مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تتكاثر بشكل مباشر في العصارة الخلوية الخلية المضيفة، أو في حجرات فجوي المتخصصة 1. خلال المرحلة الأولى من العدوى الحصول المنضوية معظم مسببات الأمراض إما عن طريق البلعمة من قبل خلايا متخصصة (مثل الضامة) أو عن طريق بنشاط على تعزيز امتصاص الخاصة بهم في الخلايا غير البلعمية. في الخلايا البلعمية، ويبلوع الصمامات عادة مع الجسيمات الحالة لتشكيل المقصورة الهادمة، حيث يتم هضمها الجسيمات المبتلعة. البكتيريا عصاري خلوي المتخصصة، مثل الفرنسيسيلة القتولة أو الشيجلا الفلكسنرية، هربا من تدهور phagosomal عن طريق حفز تمزق يبلوع والهروب في وقت لاحق إلى 2،3 العصارة الخلوية. وهذا يتطلب آلية المرتبطة الفوعة مثل الإمراضية جزيرة الفرنسيسيلة (FPI) أو الشيجلا الفلكسنرية T3SS، الذي يحقن البروتينات المستجيب التي تعزز فجوي تمزق 2-4. الميزات العصارة الخلوية الخلية المضيفةعدد من الحفظ مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف عادة وجود مسببات الأمراض وتحفيز المناعة الفطرية يشير 5. بالإضافة إلى ذلك، xenophagy، وهو شكل المضادة للميكروبات من الالتهام الذاتي يمكن أن تتحلل البكتيريا التي تدخل العصارة الخلوية. وعادة تكييفها البكتيريا عصاري خلوي جيدا لفظة أو الالتفاف على هذه الردود باستخدام استراتيجيات مختلفة. على سبيل المثال، الفرنسيسيلة يعدل LPS لتجنب الاعتراف المضيفة والشيجلا يمنع تجنيد الالتهام الذاتي باستخدام البروتينات المستجيب يفرز 6،7.
يعمل استراتيجية أخرى للهروب من تدهور الليزوزومية من النموذج فجوي الممرض السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية، أشار بعد ذلك إلى أنه السالمونيلا التيفية الفأرية. يستخدم السالمونيلا وT3SS لحقن المستجيبات أن يعيد يبلوع الأولي إلى مكانته داخل الخلايا، والسالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV) 8،9. التلاعب المستمر لمسارات المضيفمن الضروري الحفاظ على هذا فجوة من خلال تجنيد الدهون والمواد المغذية الأخرى إلى فجوة. في الواقع، يفشل متحولة سيفا من السالمونيلا للحفاظ على الاستقرار فجوي، ويدخل في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة في غضون ساعات بعد الإصابة، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات المناعية الفطرية والتوظيف الالتهام الذاتي 8. الهروب فجوي السالمونيلا يختلف باختلاف نوع من الخلايا التي هي الدراسات، وأظهرت عدة تقارير أنه في الخلايا الظهارية حتى WT السالمونيلا يمكن الهروب من SCV وhyperreplicate في العصارة الخلوية 10. وتشير التقارير الأخيرة التي كشف المناعي الفطري من مسببات الأمراض فجوي يعتمد أيضا على قدرة المضيف على الاعتراف وزعزعة استقرار الفجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض (PCVS) 11-14.
وبالنظر إلى أن كلا من المضيف أو البكتيريا النمط الجيني يمكن أن تؤثر على توزيع البكتيريا داخل الخلايا بين فجوي ومقصورة عصاري خلوي، فمن الضروري تحديد عدد فجوي مقابلالبكتيريا عصاري خلوي. منذ ذلك الحين، في معظم الاجهزة التجريبية مصابون الخلايا المضيفة مع بكتيريا أكثر من واحد، وبعد ذلك يمكن أن تؤوي العديد من البكتيريا في مقصورات التحت خلوية مختلفة، وهناك حاجة وهي تقنية تسمح الكمي على مستوى البكتيريا واحدة. permeabilization التفاضلي (المعروف أيضا باسم فحص حماية phagosomal) يوفر هذا القرار 2،4،10،12. ويستند الفحص على permeabilization الانتقائي للخلايا المضيفة غشاء البلازما مع ديجيتونين المنظفات، مما يترك الأغشية فجوي سليمة، وبالتالي يسمح تلطيخ الانتقائي للبكتيريا عصاري خلوي مع الأجسام المضادة. هنا نقدم بروتوكولين لتقدير حجم عصاري خلوي وفجوي السالمونيلا التيفية الفأرية باستخدام الفرق permeabilization. يوصف مبدأ هذه الطريقة في الشكل 1: مصابون نقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs) مع مرحلة ثابتة mCherry، معربا عن السالمونيلا. مرحلة ثابتة السالمونيلا بحاجة رس استخدامها لأنها downregulate التعبير عن SPI-1 T3SS، التي لولاها أن تعترف بها inflammasome NLRC4 واستحثاث موت الخلايا السريع (pyroptosis) من BMDMs 15 النشاط. بعد الإصابة تغسل الخلايا وتعامل مع 50 ميكروغرام / مل من ديجيتونين لمدة 1 دقيقة. تغسل الخلايا مرة أخرى على الفور وحضنت مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة بالإضافة إلى FITC بمناسبة البكتيريا من الوصول إلى العصارة الخلوية. بعد غسل إضافي وهي lysed خلايا خطوة ونسبة mCherry + (فجوي) وFITC + / + mCherry (عصاري خلوي) البكتيريا يتم تحديدها من قبل FACS. نحن أيضا الإبلاغ عن التكيف مع هذه الطريقة التي يمكن استخدامها إذا لم السلالات، معربا عن بروتين فلوري المتاحة (الشكل 2). يتم تقديم خطوات إضافية بعد وضع العلامات FITC التي يتم إصلاحها الخلايا وpermeabilized تماما. بعد ذلك تم تلطيخ كل البكتيريا مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة وما يقابلها من الأجسام المضادة الثانوية. ديتثم يتم ection بواسطة المجهر بدلا من تحليل FACS.
Protocol
Representative Results
Discussion
permeabilization الفرق هو طريقة سهلة وقوية لتحليل وتحديد التوزيع التحت خلوية من مسببات الأمراض البكتيرية بين المقصورات فجوي والعصارة الخلوية. وقد استخدم نفس الفحص بنجاح مع البكتيريا مثل الفرنسيسيلة القتولة 2،4 والشيجلا الفلكسنرية 12. ومع ذلك، لأن العدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف ماتياس S. ديك، رولاند F. دراير وسيباستيان رول للمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل SNSF الأستاذية PP00P3_139120 / 1 وجامعة بازل منحة المشروع ID2153162 لPB
Materials
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50ug/mL |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100ug/mL and 10ug/mL |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63x | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
