יישום חדש של החשמל חדירה הגרף (EPG) לרכישה ומדידת אותות חשמליים שביפים מסננת אלמנטים
Summary
Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.
Abstract
תכונות אלקטרו של תאים לעתים קרובות למדו במבחנה, לאחר מתנער מהם הסביבות האם שלהם. עם זאת, המחקר של הולכה חשמלית בין תאים מרוחקים באורגניזם דורש in vivo, הקלטות ללא ממצא של תאים המוטבעים בתוך הסביבה הטבעית שלהם. השידור של אותות חשמליים מפצועים לאזורים הלא-פצועים במפעל מאז ארוך מעורר את העניין של בוטנאים. השיפה, החלק החי של כלי דם הצמח שהתפשט ברחבי המפעל, כבר הניח כרקמה גדולה בשידור חשמל במפעלים. חוסר שיטות אלקטרו המתאימים מציב אתגרים רבים לחקר התכונות החשמליים של תאי השיפה in vivo. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לאלקטרופיזיולוגיה תאית של אלמנטים מסננת (SES) המשתמשת בכנימות חיים, או חרקים hemipteran השיפה האכלה אחרים, משולבת בהגר"א החדירה החשמליph מעגל (EPG). צדדיות, החוסן, והדיוק של שיטה זו אפשרו להקליט וללמוד בפירוט את האותות חשמליים הנוצר על-הפצע בSEs של ורידים של thaliana ארבידופסיס צמח מודל 1 מרכזיים. כאן אנו מראים כי EPG-אלקטרודות יכולות להיות מיושמות בקלות לקלטות אלקטרו תאיות של SES בעורקים שוליים, כמו גם ללמוד את היכולת של SES להגיב באותות חשמליים לכמה גירויים חיצוניים. גישת EPG להחיל אלקטרופיזיולוגיה תאית של SES יכולה להיות מיושמת למגוון רחב של מיני צמחים, במספר רב של שילובי צמחים / חרקים, ועבור רבים מחקר המטרה.
Introduction
היכולת לייצר אותות חשמליים למרחקים ארוכים היא תכונת יתרון של אורגניזמים רב-תאיים, המאפשרת לתגובות יעילים לגירויים חיצוניים. תכונה זו התפתחה באופן עצמאי בצמחים ובעלי חיים, ובכך מייצגת מקרה של אבולוציה מתכנסת. בהתחשב בכך שאותות חשמליים בשילוב עם פונקציות חשובות בבעלי חיים כגון העברת עצבית והתכווצות שרירים, בסיס המולקולרי, מנגנון של העברת, ופונקציה של אותות חשמליים הנוצר על-גירוי בבעלי חיים הם נושאים של מחקר אינטנסיבי. בניגוד לכך, איתות חשמלית מושרה גירוי בצמחים זכתה לתשומת לב מחקרית קטנה. למרות שיש לי צמחים אין עצבים או שרירים, נראה שיש מספיק ראיות כדי להניח שאותות חשמליים הנוצר על-הגירוי בצמחים לשחק תפקיד מפתח בתגובותיהם לגורמים סביבתיים.
השיפה, מרכיב החיים של כלי דם המפעל, כבר הניח כמשנה עיקריstrate להעברת אותות חשמליים הנוצר על-גירוי, מגירוי / פגומה לאזורי מגורה שאינם / ניזוק 2. התאים העיקריים בהשיפה הם אלמנטים המסננת (SES), תאים פשוטים יחסית, מוארכים. הקצוות של SES מחוברים לSEs האחר, ויצרו נמוכה התנגדות מתמשכת,, מערכת צינור מסננת שהתפשטה ברחבי המפעל. יש, עם זאת, מעט מאוד מחקרים על התכונות חשמליות של תאים מאוד מיוחדים אלה. במחקרים הקודמים אלה, חוקרי הגישה SEs גם עם זכוכית מיקרו-אלקטרודות 3 stylets או הוכנס-לשתול עם אלקטרודות זכוכית שמצמידות את כנימות, לאחר stylectomy (חיתוך) 4. microelectrodes הזכוכית עשוי מזכוכית נימים שהם משכו בקצה אחד עם חום לקצה קנס של פחות מ 1 מיקרומטר בקוטר, ולאחר מכן מלאה עם פתרון KCl. חוט Ag / AgCl או פלטינה, מוכנס לתוך אלקטרודת הזכוכית מלאה-KCl אז מחובר לכניסת המגבר, ורפרנטאלקטרודה מוכנסת לתוך האמבטיה המקיפה את התא של עניין, השלימה המעגל. התקנה זו מתעדת את ההבדל בפוטנציאל בין האלקטרודה תאי הרפרנט ואלקטרודה המדידה תאית, כלומר, פוטנציאל הממברנה של התא 5. בשיטה זו, Umrath עשה ההקלטה תאית הראשונה מתא צמח, באמצעות Nitella אצות 6,7. Nitella הוא אורגניזם פשוט יחסית עם תאים גדולים, ולכן נוח לניסויי אלקטרופיזיולוגיה תאיים. לעומת זאת, ההכנסה של אלקטרודות זכוכית תאיות לתוך התאים הקטנים של צמחים רב-תאי, תלת-ממדיים של כדור הארץ היא תובענית מבחינה טכנית, דורשת חוקר מיומן, כמו גם להדמיה מתוחכמת, מיקרומניפולציה, וציוד נגד רעידות. למרות אלקטרודות זכוכית מתאימות כדי להקליט מהתאים שטחיים בצמחים, כגון תאי האפידרמיס שורש 8, recordin תאיתGS מהתאים מוטבע עמוק ברקמה של הצמח, כגון SES, תגובות הנגרמים נזק סיבה סבירה מאוד, מבלבל את התוצאות. בשנת 1989, פרום וEschrich דיווחו על השימוש בשיטה חלופית, שנקראו "שיטת הכנימה ', שבו אלקטרודות זכוכית הם מצמידים לstylets כנימה לאחר stylectomy 4. שיטת הכנימה היא פולשנית, כי stylets גמיש לא לגרום נזק לרקמות או תאים כאלקטרודות זכוכית לעשות. stylets הכנימה הוא ההמצאה הגדולה של הטבע לחדירת צמח, וכנימות הן הרבה יותר מאשר בני אדם מיומנות במציאת SES. למרבה הצער, שיטה זו היא גם כנימה תובענית ביותר במונחים של מומחיות וציוד טכניים. בנוסף, ההצלחה של כל ניסוי שמיישם טכניקה זו תלויה לחלוטין בלהיות במצב האכלת כנימה – עם stylet הוכנס ביציבות לSE, בעת stylectomy. חשיבה ברטרוספקטיבית, אפשר לראות שהסיכויים הצלחה של טכניקה זו היו יכולים להיות שליmproved על ידי הוספה להגדרת ניסוי מכשיר המאפשר זיהוי או לא stylet הכנימה הוא בSE בעת החלת stylectomy.
בשנת 1964, מקלין וקינסי תיארו "מערכת ניטור אלקטרונית" לחקר התנהגות ההאכלה של כנימות בזמן אמת 9,10. במערכת זו, הכנימה והצמח-חדר stylet שולבו מעגל חשמלי. מאוחר יותר, בשנת 1978, Tjallingii המציא גרסה שונה של המערכת, הנקרא מערכת "חשמל חדירה גרף" (EPG) 11,12. בעוד מערכת הניטור האלקטרונית המקורית הייתה רגישה לפוטנציאלים-מקור התנגדות בלבד, עם מערכת ה- EPG, כוח electromotive (EMF) שמקורה פוטנציאלים, כלומר, שנוצרו במפעל או בחרקים, יכולים להיות מוקלטים, בנוסף לפוטנציאל הנובע מ התנגדות (R) בחרקים. זה מייצג שיפור חשוב, משום ששניהם אות הרכיבים, EMF וR,לספק מידע רלוונטי ביולוגי על אירועים במהלך חדירת מפעל על ידי כנימות. מה עושה קדם מגבר EPG רגיש לR-הרכיבים הוא התנגדות הקלט הנמוכה יחסית של 1 GΩ, שהוא קרוב לממוצע של התנגדות צמח / כנימה. מתח היסט קטן (איור 1, V) בסך של כ +100 mV מוחל על הצמח, אשר לאחר מכן מחולק על פני צמח וחרקים בצד אחד, והתנגדות הקלט בצד השני. המתחים ושינוייהם נמדדים בנקודה (איור 1 א ', ב') בין החרקים ונגד הקלט. לכן, R-הרכיבים מייצגים אפנון התנגדות צמח-כנימה של מתח ההיסט, ואילו EMF-הרכיבים הם חלק מסוים של פוטנציאלי צמח בקצה stylet ופוטנציאלים שנגרמו בחרקים. פוטנציאלי הצמח – הרלוונטיים ביותר כאן – הם פוטנציאל בעיקר קרום של תאי הצמח ניקבו ידי stylets הכנימה. פוטנציאלי החרקים נראים בעיקרפוטנציאל הזרמה נגרמת על ידי תנועות נוזל בתוך שתי תעלות stylet, כלומר, מזון ותעלות הרוק; אין פוטנציאלי עצב או שריר פנימיים נרשמים בEPG. בפועל, פונקציות קצה stylet כקצה האלקטרודה. כל תאי הצמח טעונים שלילי בתוך ביחס למחוץ החיובי של התא. הזרם החשמלי (כלומר, התנועה של יונים טעונים בתמיסה מימית) זורמים מבפנים ללהיפך מחוץ וסגנו מאוד מוגבל בשל העמידות הגבוהה של קרום התא. בדרך כלל פוטנציאל המנוחה נשמר קבוע. עם זאת, כאשר יונים שליליים לצאת או יונים חיוביים לעבור דרך קרום התא, את פוטנציאל הקרום מופחת, כלומר, זה depolarizes '. שלילת קוטביות מתרחשת במקרה של עירור תא. יונים ולאחר מכן לעבור פנימה או החוצה כאשר תעלות יונים מסוימות בקרום נפתחות או כאשר הקרום פגום ויונים לדלוף פנימה והחוצה. כל התאים תעלות יונים ומשאבות בtהוא פלזמת קרום שיביא את פוטנציאל הממברנה לרמת המנוחה שלה על ידי שחזור הריכוז המקורי של יונים שונים בתוך התא. פוטנציאל המנוחה והשינויים שלה הם רכיבי EMF, ולכן, טכניקת EPG מתאימה למדוד אותם.
איור 1. EPG-אלקטרודות. EPG-אלקטרודה היא כנימת חיים משולבת במעגל חשמלי חדירה גרף (EPG), stylet שמוכנס לתוך אלמנט מסננת (SE) במצב האכלה יציב. אם SE-משופד stylet הוא במנוחה (פנל), המתח במעגל, שנרשם על ידי EPG, יציב וברמת מתח המנוחה (לוח C, מנוחה). אם SE הוא נרגש, depolarizes הקרום (לוח ב '), שהיא דמיינה בEPG כמו עלייה הדרגתית במתח (פנל C, שלילת קוטביות). כאיזון היוני בSE חוזר לנוח, כלומר, זה repolarizes, המתח נרשם על ידי EPG יורד בהדרגה לרמת פוטנציאל המנוחה (לוח C, repolarization). בפנל C, "" ו "B" מתייחסים לתרחישים המוצגים בלוחות A ו- B, בהתאמה. V = מקור מתח היסט מתכוונן. הר"י = נגד קלט. במקביל לנגד החיצוני 1 GΩ, יש המגבר 1.5 נגד TΩ (לוחות A ו- B, באפור) גבוהים פנימי (בopamp). בשלט רחוק של המתג מראש מגבר EPG יכול להיות שונה מרגיל לEMF-מצב, המאפשר קבלת ערכי מתח מדויקים ביותר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בחלק הבא, אנו מספקים את הקורא עם פרוטוקול בסיסי לביצוע ניסויי EPG שתקף לשני מחקרים המתמקדים בחרקים וממוקדים-צמח.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת החשמל חדירה גרף הקלטות (EPG). טכניקת EPG היא מבוססת היטב, עם 100-200 משתמשים פעילים ברחבי העולם, וזה יושם למחקרים רבים בנושאים שונים, לדוגמא: א) התנגדות צמח מארח לכנימות וחרקים נושאי stylet אחרים 13; מנגנוני תמסורת ב) וירוס צמח והפתוגן 14;</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VSR נתמכה על ידי IIF מארי קירי גרנט (פצע באדמה, ראשי התיבות של: פצע מושרה אותות חשמליים בthaliana ארבידופסיס).
Materials
| Brass connector pins | EPG Systems/hardw.shop | Φ 1.2 mm | |
| Thin copper wire | EPG Systems/hardw.shop | approx. Φ 0.2 mm | |
| Thin gold wire | EPG Systems | Φ 18 µm | |
| Soldering fluid | hardware shop | matching the soldering wire | |
| Resin-cored soldering wire | hardware shop | ||
| Styrofoam | any | ||
| Water-based silver glue | EPG systems | recipe in: www.epgsystems.eu | |
| Paper wipes | Kimberly-Clark | 5511 | |
| Soldering bolt | any | ||
| Stereomicroscope | Hund Wetzlar | minimum magnification is x10 | |
| Small scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Vortex | A. Hartenstein | L46 | |
| Watercolor brushes | any | Number 1 or 2 | |
| Air suction device | see description in: www.epgsystems.eu | ||
| Insect pins | any | No. 1 or 2 | |
| Solid table | |||
| Faraday cage | Hand made | ||
| Computer | Fujitsu Siemens | ||
| Data acquisition software | EPG Systems | Stylet+d | |
| Giga-4 (-8) Complete System | EPG Systems | ||
| includes the following: | |||
| Main control box with USB output | Di155/Di710 | 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed) | |
| EPG probes 4 (8) | 50x DC pre-amplifier | ||
| Swivel clamps on rod | |||
| DC power adaptor | bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC | ||
| Plant electrodes and cables | |||
| Additional test and ground cables |
References
- Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes. New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).
- Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. (Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway. Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).
- Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant. Planta. 200, 50-57 (1996).
- Fromm, J., Eschrich, W. Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves. Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).
- Brette, R., Destexhe, A., Brette, R., Destexhe, A. Intracellular Recordings. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Umrath, K. Untersuchungen über Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Berücksichtingung der Erregungserscheinungen. Protoplasma. 9, 576-597 (1930).
- Umrath, K. Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata. Protoplasma. 17, 258-300 (1932).
- Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance. Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).
- Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath. Experientia. 20 (10), 582 (1964).
- McLean, D. L., Kinsey, M. G. A technique for electronically recording aphid feeding and salivation. Nature. 202, 1358-1359 (1965).
- Tjallingii, W. F. Electronic recording of penetration behaviour by aphids. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).
- Tjallingii, W. F. Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets. Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).
- Alvarez, E. E., et al. Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae. Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).
- Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread. Virus Research. 186, 38-46 (2014).
- Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum. Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).
- Morris, G., Foster, W. A. Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site. Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).
