Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры

Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентные клетки, полученные из ранних эмбрионов со способностью размножаться неопределенно в пробирке при сохранении способности дифференцироваться во все типы клеток взрослого следующих реинтродукции в соответствующей стадии эмбриона (путем формирования химеру), инъекции в сингенных или иммунодефицитами (путем формирования тератомы) или в пробирке субъекта к соответствующим сигналам ^1. Дифференциация в пробирке мышиных эмбриональных стволовых клеток в нервных линий была впервые описана в 1995 году и предусматривал формирование многоклеточных подвески агрегатов (эмбриональных органов, EBS) в сыворотке крови, содержащей среде с добавлением морфогена ретиноевой кислоты ^2-4. С тех пор множество протоколов были разработаны, чтобы позволить нервной дифференциацию ^5. Многие до сих пор используют агрегацию, другие совместного культивирования с индукции типов клеток и несколько включают использование сыворотки среде. Все протоколы имеют преимуществай недостатки и точный характер нервной или нейрональные клетки продуцировали также варьируется в зависимости от используемого протокола.

Идеальным протоколом будет надежная, масштабируемая и использовать в полной мере, определенных СМИ и субстратов, поддаваться неинвазивного мониторинга процесса дифференцировки и в результате генерации чистых популяций нервных клеток-предшественников, способных быть с рисунком внешних сигналов и дифференцировать во всех нейрональных и глиальных подтипов с высокой эффективностью и выходом за относительно короткое время. В последние двенадцать лет мы используем метод для генерации нейронных клеток-предшественников и нейроны от мыши ESC в низкой плотности, свободной от сыворотки приверженцем монослоя культуры ^6-10. Этот протокол отвечает многим критериям, изложенным выше: в наших руках эффективность дифференциации была вполне согласуется в течение многих лет, и разнообразие клеточных линий, его можно масштабировать вверх или вниз (мы успешно использовать сосуды из 96-луночных планшетах с 15 см диаметр диShes) и средства массовой информации, используемые хорошо определены. Процесс поддается ИНТЕРВАЛ микроскопии для мониторинга и дифференциации различных паттерна сигналы могут быть добавлены, чтобы вызвать генерацию различных типов нейрональных подтипов (например, Shh и Fgf8 для дофаминергических нейронов ^6).

Тем не менее, есть некоторые проблемы для успешного применения этого протокола. Одним из ключевых аспектов является тщательная подготовка средств массовой информации. Мы всегда подготовить СМИ в доме, несмотря на наличие коммерческих альтернатив. Один из добавок, используемых (N2, см Protocol) имеет модификации по сравнению со стандартной, коммерчески доступные версии. Наконец, один из самых важных шагов для успешного применения этого метода является оптимальная плотность клеток в обшивке. Это происходит главным образом из-за в то время как природа аутокринная одного из индуцирующих сигналов (Fgf4 ¹¹⁾ требует, чтобы достаточные клетки присутствуют для оптимального viabilность и дифференциации, при слишком высокой плотности дифференциации ухудшается (возможно, частично из-за аутокринном производства LIF ^12). Поэтому важно, что препарат обе среды и клеточной обшивки выполнены тщательно и последовательно, чтобы обеспечить оптимальные результаты.