בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
היכולת להבחין בתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) לאבות עצביים מאפשרת המחקר של מנגנוני שליטה מפרט עצבי, כמו גם את הדור של סוגי תאים עצביים בוגרים למחקר נוסף. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבידול של ESC לאבות עצביים באמצעות, תרבות monolayer סרום ללא. השיטה היא מדרגי, יעילה וגורמת לייצור של תאים עצביים ~ 70% בתוך 4-6 ימים. זה יכול להיות מיושם על ESC מזנים שונים גדלו תחת מגוון רחב של תנאים. יכולים להיות מותר אבות עצביים להבחין נוספת לנוירונים וגליה או ניתח תפקודיים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או מולקולרי טכניקות. תהליך ההתמיינות ניתנים למיקרוסקופיה זמן לשגות ויכול להיות משולב עם השימוש בקווי כתב כדי לפקח על תהליך המפרט העצבי. אנו מספקים הוראות מפורטות על הכנת תקשורת וצפיפות תאי אופטימיזציה כדי לאפשר את התהליך לbהדואר חל על רוב קווי ESC ומגוון כלי תרבית תאים.
Introduction
תאי גזע עובריים הם תאי pluripotent נגזרו מהעובר המוקדם עם היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה תוך השמירה על היכולת להתמיין לכל סוגי התאים בוגרים הבאים השבה לעובר בשלב מתאים (על ידי יצירת חזיון תעתועים), הזרקה למארחי syngeneic או מדוכאי חיסון (על ידי יצירת תפלצת) או בנושא המבחנה 1 רמזים מתאימים. הבידול במבחנה של תאי גזע העובריים של עכבר לשושלות עצביות תואר לראשונה בשנת 1995 ומעורב ההיווצרות של אגרגטים השעיה תאיים (גופי embryoid, EBS) בתקשורת סרום המכיל תוספת החומצה רטינואית מורפוגן 2-4. מאז מגוון רחב של פרוטוקולים פותחו כדי לאפשר בידול עצבי 5. רב עדיין לנצל צבירה, אחרים תרבות משותפים עם גרימת סוגי תאים וכמה כרוכים בשימוש בסרום ללא מדיה. כל הפרוטוקולים יתרונותND חסרונות ואת האופי המדויק של עצבי או תאים עצביים המיוצרים גם משתנים בהתאם לפרוטוקול בשימוש.
הפרוטוקול האידיאלי יהיה חזק, ניתן להרחבה ולעשות שימוש באמצעי תקשורת ומצעים מוגדרים באופן מלא, להיות נוח לניטור לא פולשני של תהליך הבידול ולגרום לדור של אוכלוסיות טהורות של אבות עצביים יכול להיות בדוגמת ידי רמזים חיצוניים ולהבדיל לכל תת עצבי וגליה עם יעילות גבוהה ותשואה בזמן קצר יחסית. בעשרות השנים האחרונות שכבר משתמשים בשיטה ליצירת אבות עצביים ותאי עצב מהעכבר ESC בצפיפות נמוכה, תרבות monolayer חסיד סרום ללא 6-10. פרוטוקול זה ממלא רב של הקריטריונים המפורטים לעיל: בידיים שלנו את היעילות של בידול כבר די עקבית לאורך שנים רבות ומגוון של שורות תאים, וניתן לשנות אותו או למטה (אנו משתמשים בהצלחה כלי מ96-גם צלחות ל די קוטר 15 סנטימטריםshes) והתקשורת משמשת הם מוגדר היטב. התהליך ניתנים למיקרוסקופיה בהילוך איטי לניטור של הבידול ומגוון של רמזי דפוסים ניתן להוסיף כדי לגרום לדור של סוגים שונים של תת עצביים (למשל, ששש וFgf8 לנוירונים דופאמין 6).
עם זאת, יש כמה אתגרים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. אחד ההיבטים המרכזיים הוא הכנה קפדנית של התקשורת. אנחנו תמיד להכין את התקשורת בבית למרות זמינותן של חלופות מסחריות. יש שינויים על תקן גרסאות זמינות מסחרי, אחד התוספים המשמשים (ראה פרוטוקול N2). לבסוף, אחד הצעדים החשובים ביותר ליישום מוצלח של שיטה זו היא צפיפות התאים האופטימלית בציפוי. זה בעיקר בגלל זמן שטבע autocrine של אחד מאותות התרמה (Fgf4 11) דורש כי תאים מספיקים נוכחים כדי לאפשר viabil האופטימליity ובידול, בבידול צפיפויות גבוהות מדי הנו פגום (אולי בחלק בשל ייצור autocrine של 12 LIF). לכן חשוב שהכנת שתי התקשורת וציפוי תא מבוצעות בזהירות ובעקביות כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול הבידול העצבי monolayer כבר בשימוש במשך יותר מעשור 6. הפרוטוקול הוא יעיל ביותר, מורכב מבינוני מוגדרים, ונעשה במערכת monolayer מה שהופך את המערכת מתאימה יותר לפרה-קליני (למשל, הקרנת סמים) משתמשת. עם זאת, ישנם כמה גורמים קריטיים הקובעים את יעילות בידול. מאמר זה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).
