Summary

İzolasyon ve Farklı Yaşlı Fare Timik Greft Nakli.

Published: May 13, 2015
doi:

Summary

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Abstract

timik seçim etkinliğini düzenleyen mekanizmalar kötü tanımlanmış kalır. in vivo kendi kendine ve yabancı antijenleri için spesifik T hücrelerinin gelişmesine ve seçim analizleri burada sunulan yöntem sağlar. yaklaşım immünyetmezligi scid alıcıların içine çeşitli yaşlı farelerde türetilen timik greft implantasyonu gerektirir. Süresi nispeten kısa bir süre boyunca alıcı tam implante timus greft türetilen T hücreleri ile yeniden oluşturulmuştur. Sadece timositler, izolasyon anında timus tohum seçimi geçmesi ve olgun T hücreleri dönüşür. Bu nedenle, yaşa bağlı timik olayların bir fonksiyonu olarak aşılanan T hücrelerinin yapısı ve özgüllük değişiklikler değerlendirilebilir. Teknik uzmanlık başarılı timik transplantasyonu için gerekli olsa da, bu yöntem, in vivo olarak anormal timik fonksiyonu ve / veya homeostas sonucunda ya da bağlı olan patolojilerin geniş bir çalışma için benzersiz bir strateji sağlarolduğunu.

Introduction

Timus T hücre gelişiminde kritik olaylar 1 meydana geldiği bir organdır. Yerleşik timositleri, T hücresi reseptörü (TCR) α ve β genlerin tekrar düzenlenmesi üzerine timus 2 kortikal ve medüller bölgelerde lymphostromal ve antijen sunan hücreler (APC) ile etkileşimlerin, bir dizi geçer. Timus pozitif seçim ana majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I ve II moleküllerinin 2-3 bağlamında antijenik peptitleri tanıyan timositleri üretilmesi için kortikal timik epitelyum hücreleri (TEC) aracılık eder. Daha sonra timik negatif seçim medüller TEC veya dendritik hücrelerin (DC), MHC sınıf I ve II moleküllerinin 3 ile bağlanmış kendi proteinlerinden türetilen bu, mevcut peptidler ile bir etkileşim ile tahrik edilen reaktif timositlerin tasfiye gerektirir. Bu işlemlerin bir sonucudur geniş bir yelpazede cevap verebilmek olgun CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin bir havuz kurulmasıyabancı antijenlere kendi kendine proteinlerin 4 minimal reaktiviteye sahip iken.

timik seçim olayları verimliliği timus olgunlaşması, meduller ve kortikal TEC, timik DC alt kümesi bileşiminin sıklığı ve timik öncüleri 3 kaynağı gibi faktörlerin, bir dizi etkilenir. Özellikle, anormal timik seçim sırasıyla, bozulmuş negatif veya pozitif seçimden kaynaklanan otoimmun 5 veya immünyetmezligi patolojiler, neden olabilir. timik seçimi düzenleyen moleküler olaylar, ancak tam olarak anlaşılamamıştır. In vitro böyle reaggregate timik organ kültürleri (RTOC) 6 olarak yaklaşımları, timik seçimi ile ilgili temel olayları analiz etmek için yararlı olabilir, ancak tam sürmekte dinamiklerini recapitulate başarısız kanıtlanmıştır in vivo olaylarda. Sonuç olarak, bu timik transplantasyon dayalı yaklaşım, in vivo 7 daha iyi çalışma timosit seçim olayları için kurulmuştur </s> yedekleyin.

Bu protokol bağışık yetmezliği scid alıcı farelere yenidoğan ve yetişkin donör farelerin Thymi nakli açıklanır. Bu teknik, pozitif ve negatif timik seçimi, hem de ontogeny sırasında çeşitli T hücresi alt kümelerinin timik çıkış düzenleyen mekanizmaların çalışmasına izin verir. En son olarak, bu yaklaşım, timik Seçimin verimi, erken otoreaktif T hücrelerinin artan gelişmesine yol açan, farelerde doğumdan sonra sınırlı olduğunu göstermek için kullanılır ve yabancı antijenlere 7 için azaltılmış T hücresi repertuarı spesifik edilmiştir.

Protocol

kemirgen çalışmalar Kuzey Carolina Chapel Hill Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve tüm hayvan bakımı IACUC kurallarına uygun olarak yapıldı. Yenidoğan ve Erişkin Thymi 1. Hazırlanması Önce donör fareler euthanizing tüm reaktifler ve donanımları hazırlayın. Otoklav veya diğer uygun yöntemlerle cerrahi aletler sterilize edin. Tüm cerrahi prosedürler, steril koşullar korumak ve kirlenmeyi önlemek için bir lami…

Representative Results

Bu prosedürün başarısı az cerrahi travma gibi böbrek kapsülü altından greft doğru konumlandırma bağlıdır. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, timik greft uygun temin müteakip transplantasyon için timik bölümleri boyutlu şekilde kesilmelidir. Şekil 1' de şematik sonra, yeni doğan veya yetişkin farelerden Thymi tutarlı ve tekrarlanabilir bir T hücre nakli sonuçları ile başarılı bir subkapsüler nakli için de kullanılabilir. Belirtildiği gibi, böbrek…

Discussion

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

Materials

Ethanol  Decon Laboratories 2705HC
PBS GIBCO 14190-144 pH 7.2
Betadine Solution Purdue Products 67618-150-17
18 gauge needle BD 305195
Sutures (1.0 metric) Ethicon J493G 18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm) Clay Adams® Brand 427631
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20 Sterile, disposable
Mouse anti-CD3 Ab eBioscience 11-0031-85 Clone: 1452C11
Mouse anti-CD4 Ab eBioscience 48-0042-82 Clone: RM4-5
Mouse anti-CD8 Ab eBioscience 25-0081-82 Clone: 53-6.7
Lancet Medipoint Goldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt Invitrogen P30253
96-well round botton polypropylene plates Corning 3365
1.2mL polypropylene cluster tubes Corning 4401
5mL polypropylene round-bottom tubes BD 352002
40uM Nylon Cell Strainer Falcon 352340
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade Electron Microscopy Services 15710 Hazardous
Puralube Optical Ointment Fisher Scientific NC0138063
Lympholyte Cedarlane CL5030
60 mm cell culture dish Corning 430196 60mm x 15mm, Sterile

References

  1. Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
  3. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  4. Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
  5. Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
  6. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
  7. He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
  8. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  9. Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
  10. Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
  11. Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
  12. Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
  13. Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
  14. Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
  15. Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).

Play Video

Cite This Article
Morillon II, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.. J. Vis. Exp. (99), e52709, doi:10.3791/52709 (2015).

View Video