Summary

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

Published: May 13, 2015
doi:

Summary

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Abstract

Die Mechanismen, die die Wirksamkeit von Thymus Auswahl, zu regeln schlecht definiert. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht in vivo-Analysen von der Entwicklung und Auswahl bestimmter für Selbst- und Fremdantigene T-Zellen. Der Ansatz beinhaltet die Implantation von Thymus-Transplantate aus verschiedenen alten Mäusen in immundefiziente SCID-Empfänger ab. Über einen relativ kurzen Zeitraum die Empfänger sind mit T-Zellen aus dem Thymus implantierten Transplantats abgeleitet rekonstituiert. Nur Thymozyten Impfen der Thymus zum Zeitpunkt der Trennung zu unterziehen Auswahl und entwickeln sich zu reifen T-Zellen. Als solches können Änderungen in der Art und Spezifität der transplantierten T-Zellen als Funktion der altersabhängigen Thymus Ereignisse bewertet werden. Obwohl technische Know-how für erfolgreiche Thymus-Transplantation erforderlich ist, stellt dieses Verfahren eine einzigartige Strategie, um in vivo zu untersuchen eine breite Palette von Krankheiten, die durch oder aufgrund der abweichenden Thymus-Funktion und / oder sind homeostasist.

Introduction

Der Thymus ist ein Organ, in dem kritische Ereignisse in T-Zell-Entwicklung entstehen 1. Resident Thymozyten auf Umlagerung des T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β-Gene, durchlaufen eine Reihe von Interaktionen mit lymphostromal und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Rinde und Mark Regionen des Thymus 2. Thymus-positive Selektion durch kortikale Thymusepithelzellen (TEC) vermittelte, um Thymozyten, die antigene Peptide im Kontext der Host Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II-Moleküle erkennen 2-3 herzustellen. Nachfolgende Thymus negative Selektion bringt Spülen von autoreaktiven Thymozyten, durch eine Wechselwirkung mit Mark TEC oder dendritischen Zellen (DC), die vorhanden Peptide aus Selbstproteine ​​durch MHC-Klasse-I und II-Moleküle gebunden 3 abgeleitet angetrieben. Das Ergebnis dieser Prozesse ist die Einrichtung eines Pools von reifen CD4 + und CD8 + T-Zellen in der Lage, ein breites Spektrum reagierenFremdgene während sie eine minimale Reaktivität mit Eigenproteine ​​4.

Die Effizienz des Thymus Auswahlereignisse durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich Thymus-Reifung, die Häufigkeit der Mark und kortikaler TEC Teilzusammensetzung Thymus DC, und die Source des Thymus Vorstufen 3 beeinflusst. Bemerkenswert ist, können abweichende Thymus-Auswahl bei Autoimmun 5 oder immundefizienten Pathologien, die von eingeschränkter negative oder positive Selektion entstehen beziehungsweise führen. Die molekularen Ereignisse regulieren Thymus Auswahl, sind jedoch kaum verstanden. In vitro-Ansätze wie reaggregieren Thymus-Organkulturen (RTOC) 6, haben sich als nützlich für die Analyse von Basisereignissen mit Thymus Auswahl zugeordnet ist, aber nicht, um die Dynamik der laufenden vollständig rekapitulieren In-vivo-Veranstaltungen. Als Folge wurde dieses Thymus-Transplantation-basierten Ansatz für eine bessere Studien thymocyte Auswahl Veranstaltungen in vivo 7 fest </sup>.

Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation Thymi von Neugeborenen und erwachsenen Spendermäusen in immundefiziente SCID-Empfängermäuse. Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Mechanismen, die positive und negative Selektion Thymus sowie Thymusfunktion verschiedener T-Zell-Teilmengen während der Ontogenese regulieren. In jüngster Zeit wurde dieser Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass die Effizienz des Thymus Auswahl früh nach der Geburt in Mäusen führt zu einer erhöhten Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen, und für die Fremdantigene 7 eine reduzierte T-Zell-Repertoire spezifisch.

Protocol

Die Maus-Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill und alle genehmigten Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC. 1. Herstellung von Neugeborenen und Erwachsene Thymi Bereiten Sie alle Reagenzien und Geräte vor euthanizing Spendermäusen. Sterilisieren chirurgischer Instrumente durch Autoklavierung oder andere geeignete Verfahren. Alle chirurgischen Verfahren müssen unter einer Haub…

Representative Results

Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von minimalen chirurgischen Traumas sowie die genaue Positionierung der Prothese unterhalb der Nierenkapsel. Der Thymus Transplantat sollte geschnitten angemessen sicherzustellen bemessen Thymus Abschnitte für eine nachfolgende Transplantation, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach der schematischen Darstellung in Figur 1 kann Thymi aus neugeborenen oder erwachsenen Mäusen für eine erfolgreiche Transplantation subkapsuläre mit eindeutigen und repro…

Discussion

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

Materials

Ethanol  Decon Laboratories 2705HC
PBS GIBCO 14190-144 pH 7.2
Betadine Solution Purdue Products 67618-150-17
18 gauge needle BD 305195
Sutures (1.0 metric) Ethicon J493G 18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm) Clay Adams® Brand 427631
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20 Sterile, disposable
Mouse anti-CD3 Ab eBioscience 11-0031-85 Clone: 1452C11
Mouse anti-CD4 Ab eBioscience 48-0042-82 Clone: RM4-5
Mouse anti-CD8 Ab eBioscience 25-0081-82 Clone: 53-6.7
Lancet Medipoint Goldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt Invitrogen P30253
96-well round botton polypropylene plates Corning 3365
1.2mL polypropylene cluster tubes Corning 4401
5mL polypropylene round-bottom tubes BD 352002
40uM Nylon Cell Strainer Falcon 352340
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade Electron Microscopy Services 15710 Hazardous
Puralube Optical Ointment Fisher Scientific NC0138063
Lympholyte Cedarlane CL5030
60 mm cell culture dish Corning 430196 60mm x 15mm, Sterile

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Cite This Article
Morillon II, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.. J. Vis. Exp. (99), e52709, doi:10.3791/52709 (2015).

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