Summary

L'isolement et la transplantation de différents âgées murins thymiques greffes.

Published: May 13, 2015
doi:

Summary

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Abstract

Les mécanismes qui régulent l'efficacité de la sélection thymique restent mal définis. La méthode présentée ici permet dans les analyses in vivo du développement et de la sélection des cellules T spécifiques de soi et des antigènes étrangers. L'approche implique l'implantation de greffes de thymus provenant de souris âgées dans divers destinataires SCID immunodéficientes. Au cours d'une période relativement courte de temps les destinataires sont entièrement reconstituées avec des cellules T dérivées du thymus greffon implanté. Ensemencement Seulement thymocytes le thymus au moment de la sélection et de l'isolement subissent développer en cellules T matures. En tant que tel, les changements dans la nature et la spécificité des cellules T greffées en fonction de l'âge thymiques événements dépendants peuvent être évaluées. Bien que l'expertise technique est nécessaire pour la transplantation thymique succès, cette méthode fournit une stratégie unique d'étudier in vivo un large éventail de pathologies qui sont dues à un ou résultat de la fonction et / ou homeostas thymique aberranteest.

Introduction

Le thymus est un organe dans lequel les événements critiques dans le développement des cellules T se produisent 1. Thymocytes résidents, sur réarrangement du récepteur des cellules T (TCR) α et β gènes, sont soumis à une série d'interactions avec des cellules de lymphostromal et présentant l'antigène (APC) dans les régions corticales et médullaires du thymus 2. Sélection positive thymique est médiée par les cellules épithéliales thymiques corticales (TEC) pour produire thymocytes qui reconnaissent des peptides antigéniques dans le contexte de l'hôte du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II molécules 2-3. Après sélection négative thymique implique purge des thymocytes autoréactifs, entraînée par une interaction avec TEC médullaire ou des cellules dendritiques (DC) que les peptides présents dérivés de protéines du soi liés par le CMH de classe I et II 3 molécules. Le résultat de ces processus final est la création d'un pool de cellules matures CD4 + et CD8 + T en mesure de répondre à un large éventaildes antigènes étrangers tout en présentant une réactivité minimale de quatre protéines du soi.

L'efficacité des événements de sélection thymiques est influencée par une multitude de facteurs, y compris la maturation thymique, la fréquence des médullaire et corticale TEC, la composition de sous-ensemble de thymique DC, et la source des précurseurs thymiques 3. Notamment, la sélection thymique aberrante peut entraîner des auto-immunes 5 ou immunodéficientes pathologies, qui découlent de la sélection négative ou positive avec facultés affaiblies, respectivement. Les événements moléculaires régulant la sélection thymique, cependant, sont mal comprises. Approches in vitro tels que des cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) 6, se sont avérées utiles pour l'analyse des événements de base associés à la sélection thymique, mais ne parviennent pas à récapituler pleinement la dynamique des cours dans les événements vivo. En conséquence, cette approche basée sur la transplantation-thymique a été créé afin de mieux les événements de sélection des thymocytes d'étude in vivo 7 </sjusqu'à>.

Ce protocole décrit la transplantation thymus de souris donneuses nouveau-nés et les adultes dans des souris immunodéficientes SCID bénéficiaires. Cette technique permet l'étude des mécanismes qui régissent la sélection thymique positive et négative, ainsi que la sortie du thymus de différents sous-ensembles de cellules T au cours de l'ontogenèse. Plus récemment, cette approche a été utilisée pour démontrer que l'efficacité de la sélection thymique est limitée tôt après la naissance chez la souris conduit à un développement accru de lymphocytes T auto-réactifs, et un répertoire des cellules T réduite spécifiques pour des antigènes étrangers 7.

Protocol

Les études murins ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill et de tous les soins des animaux était en conformité avec les lignes directrices du IACUC. 1. Préparation du nouveau-né et de l'adulte Thymi Préparer tous les réactifs et le matériel avant l'euthanasie souris donneuses. Stériliser les instruments chirurgicaux par autoclavage ou d'autres méthod…

Representative Results

Le succès de ce procédé dépend de traumatisme chirurgical minimal, ainsi que le positionnement précis de la greffe sous la capsule du rein. Le greffon thymique doit être coupé afin d'assurer convenablement dimensionné sections thymiques pour une transplantation subséquente comme représenté sur la Figure 1. En suivant le schéma de la figure 1, thymus de souris nouveau-nés ou les adultes peut être utilisé pour la réussite de la transplantation de sous-capsulaire avec l…

Discussion

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

Materials

Ethanol  Decon Laboratories 2705HC
PBS GIBCO 14190-144 pH 7.2
Betadine Solution Purdue Products 67618-150-17
18 gauge needle BD 305195
Sutures (1.0 metric) Ethicon J493G 18" (45cm)
AUTOCLIP Wound Clips (9mm) Clay Adams® Brand 427631
Transfer pipette Fisher Scientific 13-711-20 Sterile, disposable
Mouse anti-CD3 Ab eBioscience 11-0031-85 Clone: 1452C11
Mouse anti-CD4 Ab eBioscience 48-0042-82 Clone: RM4-5
Mouse anti-CD8 Ab eBioscience 25-0081-82 Clone: 53-6.7
Lancet Medipoint Goldenrod 4mm
Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt Invitrogen P30253
96-well round botton polypropylene plates Corning 3365
1.2mL polypropylene cluster tubes Corning 4401
5mL polypropylene round-bottom tubes BD 352002
40uM Nylon Cell Strainer Falcon 352340
16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade Electron Microscopy Services 15710 Hazardous
Puralube Optical Ointment Fisher Scientific NC0138063
Lympholyte Cedarlane CL5030
60 mm cell culture dish Corning 430196 60mm x 15mm, Sterile

References

  1. Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell. 49 (2), 273-280 (1987).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).
  3. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
  4. Schwartz, R. H. Acquisition of immunologic self-tolerance. Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).
  5. Kishimoto, H., Sprent, J. A defect in central tolerance in NOD mice. Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).
  6. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures. Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).
  7. He, Q., et al. Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner. J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).
  8. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Chapter 6. Immunophenotyping. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  9. Rice, H. E., et al. Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations. J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).
  10. Markert, M. L., et al. Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome. N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).
  11. Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. Thymus transplantation. Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).
  12. Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).
  13. Albuquerque, A. S., et al. Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation. PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).
  14. Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly. Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).
  15. Savino, W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).

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Cite This Article
Morillon II, Y. M., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.. J. Vis. Exp. (99), e52709, doi:10.3791/52709 (2015).

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