على الطريقة الأنزيمية لانقاذ الوسيطة الخلايا الجذعية من عينات متخدر نخاع العظم
Summary
Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.
Abstract
Mesenchymal stem cells (MSCs) – usually obtained from bone marrow – often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase – a clinically approved and readily available thrombolytic drug – clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) تلعب دورا رئيسيا في مجال الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. يمكن أن تهاجر، تفرق في مختلف أنواع الخلايا 1 وتدبر، مما يجعلها مثالية للمرشحين لعلاجات ذاتي 2،3. في الآونة الأخيرة، والتجارب السريرية باستخدام اللجان الدائمة لإصلاح العظام والغضاريف، أطلقت الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف أو أمراض القلب 4. هذه اللجان الدائمة يمكن أن تحصد من أنسجة الحبل السري أو الدهنية ولكن تم الحصول على النتائج الواعدة من نخاع العظام الخلايا الجذعية المستمدة 5.
قمة الحرقفي تسمح لجمع كمية كبيرة من نخاع العظام وبالتالي بمثابة الموقع الرئيسي للطموح 6. ومع ذلك، فإن نوعية نضح تتناقص مع زيادة حجم النخاع العظمي سحبها. في حين أن 5 مل الأولى من نخاع العظام نضح تحتوي على اللجان الدائمة ذات جودة عالية، وسحب كميات أكبر يؤدي إلى التخفيف من نضح مع الطرفية و الدمROM العظام أوعية دموية غاية 7. بسبب السوية العرطلة والصفائح الدموية الحالية، شفاطات نخاع العظام عرضة للتخثر، ما لم يتم استخدام مضادات التخثر. ولكن حتى مع مضادات التخثر، قد تحدث الجلطات.
في نخاع العظام، واللجان الدائمة تمثل سوى نسبة صغيرة من تجمع الخلايا مجموع 8 ولها أن تتوسع في الثقافة بالنسبة لمعظم هندسة الأنسجة أو التطبيقات العلاجية 4. نوعية مثل هذه الثقافة يعتمد إلى حد كبير على بركة الخلية الأولي، أي.، والتنوع والانطلاق ارتفاع عدد 9. انخفاض أعداد اللجان الدائمة من السحب يمكن تفسيرها جزئيا تقلب المانحة. من ناحية أخرى، اللجان الدائمة من عينات جودة منخفضة تتطلب وقتا أطول في الثقافة والركض تمتد لتصل إلى العدد المطلوب من الخلايا. في كلتا الحالتين، الركض بمد هو مصدر الشيخوخة الخلية ويمكن أن يؤدي إلى فقدان التمايز المحتملين 10. لذلك، بروتوكولات والتى تزيد من خلية ذ الأمثلدرع ومنع من الآثار الضارة يجب أن تكون وضعت 11،12.
عندما بدأنا العمل مع اللجان الدائمة الكلاب، كنا مندهش لرؤية أن نحو ثلاثة من كل أربعة الكلاب عينات نخاع العظم الواردة الجلطات، في حين كانت العينات البشرية متخدر لحسن الحظ (واحد من كل عشرة) أقل تواترا. من ناحية أخرى كان ليس من المستغرب، أن لاحظنا انخفاض العوائد الكثير من اللجان الدائمة من عينات متخدر. لحل القضية المتكررة من عينات متخدر، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام يوروكيناز المخدرات التخثر بدلا من اختزال.
يمكن علاج التخثر تصدي تهدد الحياة حالات مثل انسداد الأوعية الدموية مما يسبب النوبات القلبية والسكتة الدماغية أو الانسدادات بسبب تخثر غير المرغوب فيه. وهي تعمل عن طريق تدهور الجلطات من خلال الانقسام الأنزيمية من الفيبرين من قبل بلازمين والأنزيمية منشط تفعيل. وعلى الرغم من استخدام واسع لعلاج المرضى، لا توجد إلا عدد قليل جدا من المطبوعات التي تستخدم الأنشطة التخثرلالتطبيقات المختبرية لانقاذ عينات متخدر، مع التركيز في الغالب على الخلايا الليمفاوية. في عام 1987، Niku وآخرون. وصف استخدام ستربتوكيناز لتذويب الجلطات الدموية مما أدى إلى الخلايا الليمفاوية وظيفية بعد 13 وأربع سنوات، دي فيس وآخرون. مدد استخدام ستربتوكيناز لعزل خلايا سرطان الدم من الدم ونخاع العظام لتطبيقات تدفق cytometric 14. ويشير المنشور أكثر حداثة استخدام Alteplase لتشخيص السرطان 15. أثناء استخدام نهج الأنزيمية نفسه، يركز بروتوكول لدينا في عزلة متعددة القدرات اللجان الدائمة نخاع العظم شكل توفير أداة للباحثين في مجال الخلايا الجذعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عادة نحن عينة نخاع العظام في حين أن المريض يخضع لعملية جراحية (في حالتنا جراحة العمود الفقري في المقام الأول)، مع ميزة أن ليس لديها سوى عمل إضافي قليلا إلى أن تتم من قبل أفراد في غرفة العمليات. على الرغم من أن عينات مختلطة مع سترات الصوديوم مباشرة بعد الانسحاب، كان الع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Foundation Grant CR3I3_140717/1 and the Swiss Paraplegic Foundation.
Materials
| Basal Medium Components | ||
| PenStrep 100X | Gibco | 15140122 |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B |
| MEM Alpha w/ Nucleoside, w/ stable Glutamine | Amimed | 1-23S50-I |
| FBS Heat Inactivated | Amimed | 2-01F36-I |
| Amphotericin B | Applichem | A1907 |
| Adipogenic Medium Components | ||
| DMEM-HAM F12 + GlutaMAX | Amimed | 1-26F09-I |
| Insulin | Sigma | I5500 |
| Rabbit serum | Gibco | 16120099 |
| Dexamethasone | Applichem | D4902 |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 |
| Biotin | Sigma | B4639 |
| Rosiglitazone | Sigma | R2408 |
| Pantothenate | Sigma | P5155 |
| Oil Red-O | Sigma | O0625 |
| Osteogenic Medium Components | ||
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 |
| ß-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
| Silver nitrate (AgNO3) | Sigma | S6506 |
| Chondrogenic Medium Components | ||
| Biopad – sponge shaped medical device | Euroresearch | |
| L-proline | Sigma | P5607 |
| Insulin-Transferrin-Selenium X | Gibco | 51500056 |
| Human transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A3157 |
| Nuclear fast red | Sigma | N8002 |
| Generic | ||
| Tri-Sodium citrate dihydrate | Applichem | A3901 |
| PBS | Applichem | 964.9100 |
| Urokinase | Medac | 1976826 |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 |
| Giemsa stain | Applichem | A0885 |
| Formaldehyde | Applichem | A0877 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Applichem | A0655 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A1584 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Applichem | A3618 |
| Guanidine hydrochloride | Applichem | A1499 |
| Consumables | ||
| 50 mL reaction tube | Axygen | SCT-50ML-25-S |
| 10 mL syringe | Braun | 4606108V |
| Sterican needle (22G) | Braun | 4657624 |
| 1.7 mL Microtubes | Brunschwig | MCT-175-C |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 6.05935 |
| sterile forceps | Bastos Viegas, SA | 489-001 |
| sterile scalpel | Braun | 5518059 |
| Primaria cell cuture dish | Falcon | 353803 |
| C-Chip Neubauer Improved | Bioswisstech | 505050 |
| cell culture flask – Flask T300 | TPP | 90301 |
| Equipment | ||
| Microbiological biosafety cabinet class II | Skan | 82011500 |
| water bath | Memmert | 1305.0377 |
| Stripettes Serological Pipette 5ml | Corning | 4487-200ea |
| microscope | Olympus | CKX41 |
| humidified incubator Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 |
| Heraeus Multifuge 1S-R | Thermo scientific | 75004331 |
References
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30 (1), 42-48 (2002).
- Wang, S., Qu, X., Zhao, R. C. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19 (2012).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Malempati, S., Joshi, S., Lai, S., Braner, D. A., Tegtmeyer, K. Videos in clinical medicine. Bone marrow aspiration and biopsy. N Engl J Med. 361 (15), e28 (2009).
- Cuthbert, R., et al. Single-platform quality control assay to quantify multipotential stromal cells in bone marrow aspirates prior to bulk manufacture or direct therapeutic use. Cytotherapy. 14 (4), 431-440 (2012).
- Veyrat-Masson, R., et al. Mesenchymal content of fresh bone marrow: a proposed quality control method for cell therapy. Br J Haematol. 139 (2), 312-320 (2007).
- Lazarus, H. M., Haynesworth, S. E., Gerson, S. L., Rosenthal, N. S., Caplan, A. I. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant. 16 (4), 557-564 (1995).
- Bertolo, A., et al. An in vitro expansion score for tissue-engineering applications with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Casiraghi, F., Remuzzi, G., Abbate, M., Perico, N. Multipotent mesenchymal stromal cell therapy and risk of malignancies. Stem Cell Rev. 9 (1), 65-79 (2013).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol. 7, 14 (2006).
- Niku, S. D., Hoon, D. S., Cochran, A. J., Morton, D. L. Isolation of lymphocytes from clotted blood. J Immunol Methods. 105 (1), 9-14 (1987).
- De Vis, J., Renmans, W., Segers, E., Jochmans, K., De Waele, M. Flow cytometric immunophenotyping of leukemia cells in clotted blood and bone marrow. J Immunol Methods. 137 (2), 193-197 (1991).
- St Antoine, A., et al. Application of thrombolytic drugs on clotted blood and bone marrow specimens to generate usable cells for cytogenetic analyses. Arch Pathol Lab Med. 135 (7), 915-919 (2011).
- Kisiel, A. H., et al. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res. 73 (8), 1305-1317 (2012).
- Bertolo, A., et al. Influence of different commercial scaffolds on the in vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus-like cells. Eur Spine J. 21, S826-S838 (2012).
- Makridakis, M., Roubelakis, M. G., Vlahou, A. Stem cells: insights into the secretome. Biochim Biophys Acta. 1834 (11), 2380-2384 (2013).
- Benvenuti, S., et al. Rosiglitazone stimulates adipogenesis and decreases osteoblastogenesis in human mesenchymal stem cells. J Endocrinol Invest. 30 (9), RC26-RC30 (2007).
- Jaiswal, N., Haynesworth, S. E., Caplan, A. I., Bruder, S. P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 64 (2), 295-312 (1997).
- Patel, A. Tissue banking for research–bench to bedside and back–myth, reality or fast fading reality at the dawn of a personalised healthcare era. Cell Tissue Bank. 12 (1), 19-21 (2011).
- Smith, H. W., Marshall, C. J. Regulation of cell signalling by uPAR. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 23-36 (2010).
