Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein ernstes Gesundheitsproblem. Trotz einer großen erbliche Komponente auf AUD, wenige Gene wurden eindeutig in ihrer Ätiologie in Verbindung gebracht. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen, die alkoholbedingte Verhaltensweisen und hält daher ein großes Versprechen für die Identifizierung und das Verständnis der Funktion von Genen, die AUD beeinflussen. Die Verwendung der Drosophila-Modell für diese Art von Untersuchungen hängt von der Verfügbarkeit von Assays, die zuverlässig Verhaltensreaktionen auf Ethanol zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine für die Beurteilung Ethanol Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Fliegen-Assay. Ethanol Empfindlichkeit in diesem Test gemessen wird durch das Volumen und die Konzentration von Ethanol verwendet wird, eine Vielzahl von zuvor berichtet, genetische Manipulationen, und auch die Länge der Zeit beeinflusst die Fliegen ohne Nahrung unmittelbar vor der Prüfung untergebracht. Demgegenüber Ethanol sensitivity in diesem Test gemessen wird, nicht von der Kraft der Fliegen Handhabung, des Geschlechts der Fliegen, und Ergänzung des Wachstumsmediums mit Antibiotika oder lebende Hefe beeinflußt. Drei verschiedene Methoden zur Quantifizierung von Ethanol Empfindlichkeit beschrieben, die alle zu wesentlichen nicht unterscheidbar Ethanolsensitivität Ergebnisse. Durch die Skalierbarkeit dieses Tests, kombiniert mit seiner Gesamt Einfachheit zu Set-up und relativ niedrige Kosten, machen es für kleine und große genetische Analyse von Ethanolsensitivität und schnelle Toleranz in Drosophila geeignet.
Introduction
Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein enormes Gesundheitsproblem weltweit (in 1 überprüft). Obwohl die Mechanismen, die der Entwicklung von AUD komplex sind, sind diese Erkrankungen einen wichtigen genetischen Komponente (zB 2). Die große Erblichkeit der AUD und der konservierten Verhaltensreaktionen auf auf viele Arten (in 3,4 prüft) haben starkes Interesse an der Verwendung von genetischen Modellorganismen, um die Beteiligung bestimmter Gene in Ethanol bezogene Verhaltensweisen gegenüber ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen der Untersuchung erzeugten Ethanol AUD. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, hat als einer der führenden Modellorganismus für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen der Ethanol-Verhalten (in 3,4 prüft) entstanden. Studium der Fliegen haben Rollen für mehrere Signalwege in Verhaltensreaktionen auf Ethanol (in 5 mit Beiträgen) hervorgehoben. Interessanterweise, die Verhaltens respons beeinflussen einige der Gene und Signalwegees zu Ethanol in Fliegen auch in Nagetier Ethanolrelevante Verhaltensweisen und / oder menschlichen AUD (zB 6-14) in Verbindung gebracht. Die Erhaltung der Mechanismen, die Ethanolrelevante Verhaltensweisen zwischen den Arten, zusammen mit der Suite von genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Drosophila-Modellsystem, unterstreichen den Nutzen der Fruchtfliege Modell zur Untersuchung der Genetik von Verhaltensreaktionen auf Ethanol.
Empfindlichkeit 15,16 und der Toleranz (in 17 überprüft), um beim Menschen Ethanol wird zur Entwicklung von AUD verbunden. Beide Verhaltensreaktionen auf Ethanol in Fliegen über eine Vielzahl von Labortests (in 3,4 Bewertung) modelliert werden. Alle der Fliegen Assays den Autoren bekannt sind auf beiden zeitabhängigen Ethanol-induzierten Sedierung / Inkoordination oder zeitabhängigen Rückgewinnung aus Ethanol Sedierung basiert.
In einem früheren Artikel aus unserer Gruppe über die Genetik der Ethanolsensitivität und rapid Toleranz in Drosophila, einem Verhaltenstest basierend auf Ethanoldampf-induzierten Sedierung von Fliegen wurde 18 verwendet. Testing in diesem Test wurde durch die Übertragung von Live-Erwachsenen initiiert fliegt ohne Betäubung, um Nahrung zu leeren Fläschchen, Trapping die Fliegen in den Fläschchen mit einer Celluloseacetat-Stecker, Zugabe von Ethanol zu der Spitze (dh nicht-fly-Seite) des Celluloseacetats Stecker, und Abdichten der Ampulle, die Fliegen, Celluloseacetat Stecker und Ethanol mit einem Silikonstopper (siehe schematische Abbildung S3 Referenz 18). Mehrere Fläschchen, die verschiedene Gruppen von Fliegen wurden parallel untersucht, der Durchsatz erhöht dieses Assays. Die Fläschchen wurden eine anonyme Code gegeben und Experimentatoren wurden Behandlungsgruppe geblendet, um unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Beurteilung der Sedierung zu vermeiden. In einer Standard-Experiment fliegt in Ampullen wurden sanft mit 6-Minuten-Intervallen abgegriffen und nach einer 30 Sekunden Erholung, wurde die Anzahl der sediert Fliegen in jedem Fläschchen gezählt und converted, um die prozentuale aktive Fliegen. Fliegen absorbiert Ethanoldampf aus dem Celluloseacetat-Plug in einem zeitabhängig, was zu einem progressiven Anstieg der internen Ethanol 18 und Sedierung (siehe Referenz 18 und 1A und 1B in diesem Bericht). Sedierung in diesem Test wurde operativ wie Fliegen (i) stehen in der Abwesenheit von Walking oder (ii) auf dem Rücken liegend mit oder ohne mit den Flügeln schlugen definiert. Hier wird diese Ethanol Sedierung Assay im Detail beschrieben, wird eine weitere Betriebsoptimierung relevant Verwendung vorgesehen, und der Assay wird verwendet, um den Beitrag der Nahrungsergänzung Optionen auf fly Sedierung Empfindlichkeit ansprechen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einfache Tests, die reproduzierbar quantifizieren sinn Phänotypen sind von großem Wert für die Analyse des Verhaltens. Die hier beschriebenen Arbeiten werden mehrere praktische Aspekte eines Tests zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Drosophila. Obwohl nicht ein Schwerpunkt dieser Arbeit, sind Verhaltensanalysen durch die Erhaltung der Umwelt und genetischen Hintergrund Konstante für Probanden in einer Studie erleichtert. Ferner sollten Vergleiche typischerweise zwische…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. 유전학. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
