Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in<em> Drosophila</em
Summary
Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.
Abstract
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een ernstig gezondheidsprobleem uitdaging. Ondanks een grote erfelijke component AUD, zijn weinig genen eenduidig betrokken bij hun etiologie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, is een krachtig model voor het verkennen van moleculair genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan alcohol gerelateerde gedrag en daarom bezit is van een grote belofte voor het identificeren en begrijpen van de functie van genen die AUD beïnvloeden. Het gebruik van het Drosophila model voor deze soorten onderzoeken afhankelijk van de beschikbaarheid van testen die gedragsreacties ethanol betrouwbaar te meten. Dit rapport beschrijft een test geschikt is voor de beoordeling van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in vliegen. Ethanol gevoeligheid gemeten in deze assay wordt beïnvloed door het volume en de concentratie van ethanol gebruikt, verschillende eerder beschreven genetische manipulaties, en ook hoe lang het vliegen worden ondergebracht zonder voedsel ogenblik van de proef. Daarentegen ethanol sensitivity gemeten in deze test wordt niet beïnvloed door de kracht van vlieg behandeling, geslacht van de vliegen en suppletie kweekmedium met antibiotica of levende gist. Drie verschillende methoden voor het kwantificeren ethanol gevoeligheid beschreven uiteindelijk toe leidt kenmerken ononderscheidbaar ethanol gevoeligheid resultaten. De schaalbare karakter van deze test, in combinatie met de algehele eenvoud aan de set-up en de relatief lage kosten, maken het geschikt voor kleine en grote schaal genetische analyse van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila.
Introduction
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een enorm gezondheidsprobleem wereldwijd (beoordeeld in 1). Hoewel de mechanismen die de ontwikkeling van AUD complex, deze aandoeningen hebben een belangrijke genetische component (bijvoorbeeld 2). De grote erfelijkheid van AUD en de geconserveerde gedragsreacties naar ethanol in heel veel soorten (beoordeeld in 3,4) sterke interesse in het gebruik van genetisch model organismen om de betrokkenheid van specifieke genen in-ethanol gerelateerd gedrag in de richting van een beter inzicht in de moleculaire basis van onderzoeken hebben gegenereerd AUD. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een toonaangevende modelorganisme voor het verkennen van moleculair-genetische mechanismen van-ethanol gerelateerd gedrag (beoordeeld in 3,4). Studies in vliegt hebt gemarkeerd rollen voor verschillende signaalwegen in gedragsreacties om ethanol (beoordeeld in 5). Intrigerend sommige genen en pathways die gedragsmatige respons beïnvloedenes ethanol in vliegen zijn ook betrokken knaagdieren ethanol gerelateerd gedrag en / of menselijke AUD (bijvoorbeeld 6-14). Het behoud van mechanismen achter-ethanol gerelateerd gedrag alle species, in combinatie met de reeks genetische gereedschap in het Drosophila modelsysteem onderstrepen het nut van de fruitvlieg model voor onderzoek naar de genetica van gedragsreacties ethanol.
Gevoeligheid 15,16 en tolerantie (besproken in 17) tot ethanol bij de mens is verbonden met de ontwikkeling van AUD. Beide gedragsreacties ethanol kan worden gemodelleerd in vliegen via diverse laboratorium testen (besproken in 3,4). Alle van de vlieg assays die tot op heden zijn gebaseerd op ofwel tijdsafhankelijke-ethanol geïnduceerde sedatie / coördinatiestoornissen of tijdsafhankelijke herstel van ethanol sedatie.
In een vorig artikel uit onze groep op de genetica van ethanol gevoeligheid en rAPID tolerantie in Drosophila, een gedrags-test op basis van ethanol-damp geïnduceerde sedatie van vliegen werd gebruikt 18. Testen in deze test is geïnitieerd door het overdragen van live adult vliegt zonder verdoving om voedsel flesjes leeg, het vangen van de vliegen in de injectieflacons met een celluloseacetaat stekker, het toevoegen van ethanol naar de top (dat wil zeggen, niet-fly kant) van de cellulose-acetaat stekker, en het afdichten van de flacon met vliegen, celluloseacetaat plug en ethanol met een siliconen stopper (zie schema in figuur S3, referentie 18). Meerdere flacons die verschillende groepen vliegen werden beoordeeld in parallel, waardoor doorvoer van deze assay. Flesjes kregen een anonieme code en onderzoekers waren blind voor de behandeling groep om onbedoelde bias in de beoordeling van de sedatie te voorkomen. In een standaard experiment, vliegen in flesjes werden voorzichtig aangetikt 6 min intervallen en, na 30 seconden herstel, het aantal verdoofd vliegen in elk flesje werd geteld en Converted om procent actief vliegen. Vliegen geabsorbeerd ethanol damp uit het celluloseacetaat sluit een tijdsafhankelijke wijze, waardoor toenemende verhoging van interne ethanol 18 en sedatie (zie verwijzing 18 en figuur 1A en 1B in dit verslag). Sedatie in deze test werd operationeel gedefinieerd als vliegen (i) staan in de afwezigheid van wandelen of (ii) liggend op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels. Hier wordt deze ethanol sedatie assay beschreven, verder operationele optimalisering te gebruiken relevant verstrekt, en de test wordt gebruikt om de bijdrage van voedingssupplement opties aan fly sedatie gevoeligheid pakken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ongecompliceerde testen die reproduceerbaar kwantificeren zinvolle fenotypes zijn van grote waarde voor de analyse van het gedrag. De hier beschreven werkzaamheden hebben betrekking op een aantal praktische aspecten van een test voor het meten van ethanol sedatie gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila. Hoewel het niet een focus van dit werk, zijn gedragsanalyses bevorderd door het handhaven van het milieu en de genetische achtergrond constante voor proefpersonen in een studie. Bovendien moet vergelijki…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
These studies were supported by grants from the National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). The authors thank Jill Bettinger for helpful discussions and Jacqueline DeLoyht for technical assistance.
Materials
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A., Reilly, M. T., Lovinger, D. M. . Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. 91, (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. 유전학. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Rothenfluh, A., Troutwine, B. R., Ghezzi, A., Atkinson, N. S., Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
