بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em> Medicago truncatula</em
Summary
The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.
Abstract
مرحلة التطور الجنيني المبكر بدءا من البيضة الملقحة خلية واحدة يمر انقسام الخلايا السريع والتشكل، ويتميز شكليا لما قبل كروي، كروي، والقلب، ونسف فلقة مراحل. هذا التطور التدريجي تحت تنظيم محكم من شبكة الجزيئية المعقدة. حصاد الأجنة المبكرة كافية في مرحلة مماثلة من التنمية ضروري لتحقيق التنظيم الخلوي والجزيئي للمرحلة التطور الجنيني المبكر. هذه ليست واضحة منذ مرحلة التطور الجنيني المبكر يخضع التشكل السريع في فترة قصيرة على سبيل المثال 8 أيام لMedicago truncatula للوصول إلى مرحلة فلقة في وقت مبكر. هنا، نعالج هذه القضية من خلال النهجين. أول واحد بتأسيس الربط بين تطور الجنين وجراب التشكل في مساعدة تشير إلى مرحلة من مراحل الجنين اقحي. ويستند هذا بشكل خاص على عدد من اللوالب جراب والتنمية في العمود الفقري. وسيلة بديلة لتكمل في الجسم الحي الصورةtudies هو عن طريق إإكسبلنتس أوراق زراعة لإنتاج الأجنة الجسمية. يتضمن المتوسطة تركيبة هرمون غير عادي – وأوكسين (حمض 1-naphthaleneacetic)، وهو سيتوكينين (6 benzylaminopurine)، حمض التسقيط وحمض الجبريليك. مراحل مختلفة يمكن تمييزها المتزايد من الكالس دون تشريح.
Introduction
البقول هي ثالث أكبر عائلة من النباتات العليا مع ما يقرب من 20000 الأنواع والفيصلة القرنية (أو الفصيلة البقولية) الأسرة هي الثانية للحبوب في المساحة المحصودة والإنتاج الإجمالي 1. فول الصويا هو ثالث أكبر المحاصيل المزروعة. توفر البقوليات حوالي ثلث البروتين وثلث من الزيت النباتي للاستهلاك البشري 2. البقوليات مع قدرتها تحديد N 2 تسهم أيضا في النظم الزراعية المستدامة. Medicago truncatula، مثل فول الصويا، ومخازن البروتين والزيت في النبتات من البذور والبقوليات هو نموذج الوراثي والجيني مع الموارد الوراثية والجينوم كبيرة 3،4. في حين M. وقد مكن truncatula التقدم في فهم-البقوليات البكتريا العصوية تكافل 4 فقد استخدمت على نحو متزايد لدراسة البيولوجيا بذور البقول 5-7 والتخلق 8،9. تم نبات الأرابيدوبسيس مرحلة التطور الجنيني درس على نطاق واسع 10،11 كنها طسا غير البقوليات وتفاصيل مرحلة التطور الجنيني ليست متطابقة إلى Medicago 8،10. التطور الجنيني اقحي في M. truncatula ديها ميزات مثيرة للاهتمام، مع الغدة النخامية متعددة الخلايا المميزة، وهي suspensor endoployploid ونقل الخلية القاعدية 8.
يستخدم مرحلة التطور الجنيني الجسدية (SE) عادة لتجديد النباتات 12. في نموذج البقوليات M. truncatula، خط البذور Jemalong 2HA (2HA) تم تطويره من الوالد Jemalong أن يكون ارتفاع معدلات التطور الجنيني الجسدية 13. وقد تم مؤخرا زيادة عدد الأجنة المنتجة بشكل جوهري بإضافة كل من حمض الجبريليك (GA) وحمض التسقيط (ABA) إلى متوسطة عريقة 14. في هذه الحالة GA والعمل ABA تآزر، وهو أمر غير معتاد نظرا لأن GA وABA عادة ما تتصرف بعدوانية 14. الأجنة المنتجة من الكالس تتطور على السطح الذي يسمح مرحلة التطور الجنيني يتم تحديدها بسهولة بصرياذ وتحصد بسهولة. وجود بالقرب من خطوط إسوي التي تخلقي (2HA) وغير تخلقي (Jemalong) يسهل التحقيق في مرحلة التطور الجنيني الجسدية وجود كل المجراة في أنظمة المختبر يوفر إمكانيات التجريبية المختلفة.
فهم الآليات الخلوية والجزيئية لتطور الجنين هو ضروري لبذور التفاهم وتطوير المصنع. في البقوليات، كما هو الحال في الفلقتين أخرى، فمن النبتات من الجنين الذي تخزين المنتجات التي تستخدم لتغذية الإنسان. مرحلة التطور الجنيني المبكر ينطوي على انقسام الخلايا السريع والصحيح الجنين الزخرفة. في بعد حوالي 8 أيام الإخصاب، M. truncatula الجنين تصل إلى مراحل فلقة في وقت مبكر. لا يتم الإشارة إلى الخصائص المورفولوجية بالضبط قبل أيام بعد الإخصاب في ظروف البيوت الزجاجية. وهكذا، وهو نهج موحد فعال للإشارة إلى مرحلة الأجنة النامية قيمة في دراسة regul الجينيأوجه من أوائل مرحلة التطور الجنيني اقحي.
في هذه الورقة، ونحن نقدم اثنين من بروتوكولات موحدة لجمع الأجنة النامية للدراسات البيولوجية للمرحلة التطور الجنيني في نموذج البقول M. truncatula. أول واحد هو جمع الأجنة اقحي من خلال ربط التطور الجنيني وجراب التشكل في حين أن الثانية هي مرحلة التطور الجنيني الجسدية عبر إإكسبلنتس أوراق زراعة لتوفير أعداد كبيرة الجنين الوصول إليها بسهولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والبروتوكولات المذكورة هي نسبيا على التوالي إلى الأمام وتسمح بالتحقيق في مرحلة التطور الجنيني البقول مع كل خلية المعاصرة والتقنيات الجزيئية. نحن ندرك أن هناك مزايا وعيوب كل من المجراة في النهج المختبر. كلا السماح للمزيد من التركيز على مرحلة التطور الجنيني…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.
Materials
| P4 medium | Sigma-Aldrich | Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier | |
| Major salts | |||
| Minor salts | |||
| Vitamins | |||
| Agar | Bacto Laboratories | 214010 | Bacto agar |
| Plant hormones | |||
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| Abscisic acid | Sigma-Aldrich | A1049 | Dissolve in small amount of 1 M NaOH |
| 6-Benzylaminopurine | Sigma-Aldrich | B3274 | Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl |
| Gibberellic Acid | Sigma-Aldrich | G7645 | Dissolve in small amount of ethanol |
| Equipment | |||
| Stereo dissecting microscope | Leica | MZFLIII | Or similar |
| Light microscope | Zeiss | Axiophot | Or similar, with suitable optics |
| Digital camera | Zeiss | AxioCam HRc | Or similar |
| Sterilising leaves | |||
| 250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid | SARSTEDT | 75.9922.519 | Autoclavable |
References
- Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
- Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
- Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
- Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
- Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
- Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
- Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
- Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
- Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
- Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
- Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula – implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
- Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
- Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
- Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
- Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
- Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
- Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).
