干血斑点. 免疫和分子技术中使用的制备和加工

DBS 已经使用了100年² , 但令人惊讶的是, 在它们的制备和处理方面仍然没有普遍的共识。到目前为止, 这一重要的分析阶段的一个充分的标准化仅在新生儿筛查¹⁴领域实现, 而对于 DBS 测试的所有其他应用则存在各种不同的协议^5、16、23。为了克服这一显著的异质性, 本文介绍了在免疫和分子技术中用于制备和处理 DBS 的综合 step-by 步指令, 并对其有效性进行了评估。用于检测乙肝病毒、HCV 和 HIV 感染的标志物。以下讨论的重点主要放在所建议的议定书的不同步骤上。

在 DBS 测试的历史中, 许多不同的滤纸卡已经使用了² , 但是今天只有两个商业来源被 FDA 批准为第二类医疗器械, 用于采血^{5, 16}。这些滤卡系统具有高度的均匀性, 并且具有非常相似的吸收特性, 因此从毛细管血液中制备的分析结果不会因4% – 5%²⁸而不同。毫不奇怪, Masciotra 和同事²⁹因此在从不同来源的血液收集卡洗脱后, 检测出 HIV-1 RNA 同样很好的定性化验. 鉴于这些数据, 它可以被实际排除, 在测试耦合血清/DBS 对乙肝病毒, HCV 和 HIV 病毒感染的标志物的任何差异,¹⁷是由单独选择的过滤卡造成的。然而, 当准确量化分析物是必不可少的, source-to-source 变异可能不再是可忽略和更复杂的技术,例如, 穿孔 DBS (pdb) 作为方法为 microsampling³⁰或准备干血清斑点 (DSS)³¹可能需要应用, 而不是传统的 DBS 测试¹⁰。

因为只有少量的血液用于 DBS 测试 (一滴毛细血管血包括大约50µl)^{5, 16}, 样本量的变化是至关重要的, 而且, 诚然, 血清学结果之间的差异至少有一些在 “DRUCK 研究” 的试验过程中, 参与者自我报告的 HBV 和 HCV 的状态是归因于这个变量的。最重要的因素, 最大限度地减少 “波动” 的样本量无疑是一个正确的技术, 毛细血管采血, 这只能通过仔细和持续培训技术人员²²。此外, 作为质量控制的一项措施, 所有与星展集团合作的实验室都应该已经启动了识别的程序, 并随后排除了那些必须被认为是不满意或无效的¹⁶的 dbs 样本。

主要在艾滋病毒的背景下进行的研究³²和新生儿筛查³³表明, 高湿度可能导致分析的降解, 但迄今尚未就 DBS 应风干多久的问题达成共识.在此通信中建议至少4小时或最好是 O/N 的间隔, 因此采用了在所有相关出版物中的绝大部分使用的条件^{32, 34}存储 DBS 的数据, 随后用于 HBV 和 HCV 检测相互冲突。在 1981年, 别墅和同事³⁵, 谁应用当代分析技术, 报告说, 在 RT 的存储没有影响乙肝病毒分析的结果, 在整个观察期间的180天, 如果抗体滴是 > 1/1000, 但 DBS在15天后, 当血清中的滴只有1/100 时, 就成了边缘阳性甚至是阴性。存贮在-20 ° c 或4° c 没有导致坚固改善。相比之下, 在三十年后的一项研究中,³⁶测试了 HBV 阳性样本的复制, 作者发现抗 HBc 和抗 HBs 抗体在 RT 时稳定了183天, 而 HBsAg 在同样的条件下成为假阴性已经在63天以后。关于从 DBS 溶的乙肝病毒 DNA 检测, 病毒核酸的浓度在37° c (³⁷的至少七天内是稳定的, 或者在 RT 中被证明是 “耐” 的, 可达三周³⁸。使用两个商用的第三代免疫³⁹对抗 HCV 抗体进行检测, 在117天内提供准确的结果, 使用 DBS 样品分别储存在-20 ° c、2–8° c 和20–25° c。然而, 在-20 ° c 的存储, 导致了光学密度的最低变化。应用第四代丙型肝炎病毒 ELISA,即, Monolisa hcv-Ag-Ab 超, 在 DBS 测试的背景下, Larrat et al.⁴⁰在 RT 中存储 DBS 标本超过三天后, 观察到分析特异性急剧下降。另一方面, 在不同的条件下 (-20 ° c, 2 –8° c, 22 –26° c) 中, 由 Brandao 和同事⁴¹, 使用相同的试剂盒获得的样品在60天内得到了精确的测试结果。在不同的存储条件下, DBS 中 HCV RNA 浓度下降的观察范围从 RT 到四周后的10年内没有显著的变化, 在室温下为⁴² , 在环境温度下为⁴³。考虑到关于乙肝病毒和 HCV 抗原、核酸和抗体稳定性的这一相当矛盾的数据, 在拟议的议定书中收回一项协商一致意见似乎是合理的, 因为早先已界定了将 DBS 标本用于储存HIV 检测^{15, 30}: 用于短期沉积 (最多两周) 抗原, 病毒核酸, 和抗体被认为是稳定的 RT, 而最佳存储长期处于冰冻状态。

一般来说, 在设计洗脱协议时应考虑三参数: (1) 洗脱缓冲器;(2) 洗脱的持续时间和温度;和 (3) 洗脱体积²³。在所有相关刊物中, 绝大多数的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 被用于洗脱的 DBS, 大多数作者都添加了一种蛋白质,例如, 牛血清白蛋白 (BSA) 或吐温 20, 一种表面活性剂, 为了通过稳定蛋白质, 当它们进入溶液时, 同时阻断非特异性的绑定站点²³。只有少数报告, 直接比较了不同的洗脱缓冲在 DBS 测试的背景下, 是可用的。比利亚尔et al.³⁶,例如, 记录了所有使用的缓冲区的几乎等同的洗脱能力, 但是 PBS/BSA 0.5% 导致了非特异性反应的最低水平。一个非常相似的观察是由 Croom 和同事⁴⁴在应用遗传学系统的标本稀释剂 rLAV EIA 为从 DBS 的抗 HCV 抗体的洗脱. 由于在制备 DBS (见上图) 后的第一个小时内, 样品降解的风险非常低, 因此决定在室温下孵育斑点, 并通过温和的涵管端混合来支持洗脱过程。这种方法的优势是, 前一天穿孔的标本可以直接转移到第二天早上的例行诊断²³.洗脱缓冲液的体积应适应于随后的分析所用的最小各自的要求, 以便使稀释系数尽可能低。然而, 由于在 “DRUCK 研究”¹⁷期间必须在较短的时间内保证高样本吞吐量, 因此在前面的评估中不可能对每一个分析物的洗脱条件进行仔细的优化。因此, 为了完成整个洗脱过程的所有参数在两个单独的操作中, 使用了1000µl 的 PBS-based 缓冲器的相当不利的体积。

这一方法一方面失败 “完全在反 HBc/反 HBs 系统为那些个人感染艾滋病毒, 由于低抗体浓度;在乙肝病毒 DNA 和丙型肝炎病毒 RNA 检测方面, 它需要具有最佳分析灵敏度的分子生物学程序。¹⁷另一方面, 在整个评估过程中使用的试剂盒的高洗脱量对乙肝表面抗原、抗 HCV 和抗 HIV 的测定绝不不利。”检测乙肝表面抗原阳性材料从整体血液溶成功以敏感性98.6% 到相似地高程度和在早先研究, 部分使用了100µl, 250 µl, 或600µl, 或500µl” 17 的一个更小的洗脱容量^{,36、45、46}。97.8% 测定179血清/DBS 对抗 HCV 抗体的灵敏度与现有报告^{24、44、47、48、49}的结果相符, 这项研究的洗脱量低于5至10倍。”此外, 通过规定自己的截止点”^{17、24、48、49}或通过将样本量从20µl 增加到100µl, 对反 HCV 检测的协议进行了适当的优化。^17, 49最后, 为抗 HIV 检测而建立的分析特异性和灵敏度 (100% 个) 均等于或优于其他免疫的性能特征, 具体适应于 DBS 测试的^50、51或逐步过程与多个抗 HIV 测试的联合使用 “^17, 52。”事实上, 它们也超过了在 dbs 溶中专门开发和优化的检测抗 hiv 抗体的化验的性能记录 (Q-预防艾滋病毒 1 + 2 dbs 套件)。^{17, 53}

综合起来, 这一通信中提出的全面的 step-by 步骤协议证明是一个可行的和 user-friendly 的工具, 准备和处理 DBS, 从而可以可靠地用于诊断病毒。它允许使用自动化⁵⁴的方法, 并由于其优异的性能特性, 有潜力作为一种基础-石头为未来的普遍接受的协商一致的协议在全球 DBS 测试领域的实验室医学.