使用小鸡^GFP 神经管移植和碳水化合物染料 DiI 注射，在鸡胚胎内对神经囊细胞和血管进行双重标记

1. 神经管消融的微刀制备 用市售的钢缝纫针塑造微型刀具。 首先使用安装在电动台式磨床上的研磨轮将针头两侧夷为平地。 开始塑造手术刀，首先在粗级阿肯色州石头上使用控制的圆形运动，在针的两侧，在交替的方向。 在额外的精细级阿肯色州石头上进行相同的锐化运动，以塑造一个超精细的微型刀片，具有明确定义的尖端（图1A，B）。注：微型刀片的替代品可以是电镀金针、市售钨针或拉玻璃针。 2. 将野生类型和 GFP 鸡蛋孵化到所需的阶段 在孵化前，在冷却的孵化器中储存受精鸡蛋和转基因 GFP 鸡蛋，因为在此温度下发育已停止。储存鸡蛋几天，最多一周。 要开始开发，将野生类型和 GFP 鸡蛋水平放置在托盘上，同时在潮湿的（58 – 60%） 中孵化孵化器在37.5°C，使胚胎处于匹配阶段的神经管移植。 为了在10-12个卵子发育阶段获得胚胎进行阴道神经管移植，孵卵1.5天（33-38小时），并根据汉堡和汉密尔顿21的发展表阶段胚胎。 3. 准备鸡蛋用于窗口和移植 一次移动一个鸡蛋到定制鸡蛋架上进行窗口。用直剪刀反复敲击蛋壳上的一个小孔，在蛋尖端的上表面。 用181~2克皮下针和5毫升注射器从鸡蛋中取出2-3毫升白蛋白。去除白蛋白可降低卵子内的蛋黄，并有助于随后的窗口，而不会对胚胎造成任何损害。 丢弃白蛋白。用一小条透明胶带密封孔，用细剪刀切成大小。 使用弯曲的剪刀，在蛋壳的上表面再挖一个洞。将剪刀尖插入孔中，使剪刀与长凳平行，以圆形运动将直径约 2 厘米的窗户切入外壳顶部。 将剪刀保持静止位置，旋转鸡蛋。丢弃被移除的蛋壳盘。在E1.5，胚胎可以识别为蛋黄顶部的深黄色圆盘。 使用钳子清除掉在鸡蛋内的任何贝壳碎片。丢弃任何未受精的卵子（由浅黄色蛋黄顶部的一个小白点识别）。 4. 准备主机胚胎接受移植组织 将立体显微镜调整到眼睛水平，优化牙周光源的方向，在不引起反射的情况下充分照亮胚胎。 为了使胚胎 正常可视化，使用口管和拉玻璃微管（图1C，Oii）在较深的黄色圆盘中心下注入少量印度墨水。 准备墨水 50：50 与 PBS 含有青霉素/链霉素在 100 μg/ml 最终浓度。将微移液通过蛋黄膜插入胚胎外围，然后小心地将其尖端直接角在胚胎下面。 通过吹在口腔管上，在胚胎下面输送墨水。如果不允许口腔管管，请改为使用 1 毫升注射器。小心不要在胚胎下面引入任何可能导致污染的气泡，然后小心地取出玻璃微管。这是一个微妙的步骤，如果不精确完成，可能导致胚胎死亡。 参照汉堡和汉密尔顿21 来分阶段胚胎，并在实验室书籍中记录该阶段。 使用安装在针架上的定制微型刀片（或细钨针），在进行微手术的区域旁边的维特尔线膜中制作一个非常小的气喘。 小心地将2 -3滴PBS涂在膜撕裂上（使用玻璃微移液器和口腔管），在胚胎和膜之间创造空间。在膜中切下一个更大的窗口，以暴露将进行微手术的整个区域。 使用微型脚轮去除感兴趣的神经管区域，从整个后部神经管的横穿孔和剖面切口开始（在视频中为 somite 1 到 7 的水平）。 在神经管和索米之间进行双边切割，将神经管与周围组织分离，而不会损坏索米特。 非常轻轻地将神经管与底层的神经管分开，后者应保持完好无损。请注意，成功的神经管切除将保持所有周围的组织完好无损（图2）。 将切除的神经管吸进玻璃微管中，然后丢弃。 在实验室书中记录神经管消融水平。宿主胚胎现在准备接受供体神经管。 5. 准备捐赠移植组织 通过使用 FITC 滤镜在荧光立体显微镜下观看，选择经过窗口的舞台匹配的 GFP 胚胎。GFP荧光使得它很容易想象烟体和阶段的胚胎。 一旦确定了一个相匹配的胚胎，通过做4个切口从卵子中取出胚胎，用帕舍夫-沃尔夫弹簧剪刀（图1C，l）在胚胎周围的矩形形状，然后用胚胎勺轻轻拾起它。 将胚胎放在带硅藻聚合物底座的方形表玻璃中。用杜蒙#5钳子轻轻摇动胚胎，去除任何附着的蛋黄。取出维他林膜，用不锈钢细针（图1C）将胚胎固定在聚合物底座上。 使用弹簧剪刀，在神经管和周围索米特周围以矩形形状切开4个切口，位于从宿主胚胎中取出的相同区域。 使用塑料转移移液器，将神经管和松虫组织从供体GFP胚胎转移到含有0.2%胰腺素的手表玻璃中。 允许酶消化在RT进行10分钟，以帮助分离组织。在酶中孵育后，使用安装在手柄上的不锈钢小针手动将神经管与所有相邻组织分离。 使用玻璃微管，将分离的神经管转移到另一个手表玻璃中，其中含有10%的血清（如山羊、马或胎儿小腿），以冲洗多余的胰腺素并停止酶消化。5分钟后，解剖的神经管准备移植到小鸡主机（图2和S1）。 6. 移植组织 使用玻璃微管，小心地将解剖的神经管从表玻璃转移到主机胚胎。将神经管置于正确的前后方向，并使用微型刀块轻轻推送与小鸡宿主切除区域相邻的外植。将一小块等体附着在后部表面，或切入一个小刻痕，以识别神经管的方向。 如有必要，使用微型刀刀将去除的植物修剪到被切除区域的确切大小。 轻轻地引导神经管进入消融区域，并定位它，使后侧正确定向。使用安装在口腔管上的玻璃微移液器去除移植物周围的 PBS 和/或液体。这有助于捐赠者和宿主组织坚持和移植成为建立。 用24毫米宽的透明胶带密封整个窗户，以防止脱水和污染。 用铅笔在蛋壳上标记，并在实验室书上记录其数量，从而给幻想胚胎贴上标签。将鸡蛋返回孵化器以进一步发展。 7. 将DiI注射到宿主胚胎的血管中 在所需的实验时间点（这里，3 – 10天后），从孵化器中取出幻想胚胎，然后用直剪刀取出透明胶带，以进入卵子内的胚胎。 如有必要，使用剪刀放大外壳中的窗口。小心不要损坏胆囊膜，如果它连接到壳，这将导致出血和危及血管标签。 在蛋黄上选择一个可访问的静脉，确保血液流向胚胎。选择其中一个脉脉的分支点（图3B，C）。注：在 E6.5 – E7.5 时，可能需要用钳子轻轻将胆囊膜移到一边才能进入蛋黄静脉。E8.5之后，唯一的选择是注射到胆囊膜静脉之一，因为，在这个阶段，胆囊膜完全覆盖胚胎。 使用两个杜蒙#5钳子在选定的注射点上方取出维特尔线膜，向相反的方向撕裂。 使用 Dumont #5打破拉玻璃针，并在加载 CellTracker CM-DiI 之前将其直径调整到静脉的大致大小。在 DMSO 中以 40μg/μl 的速度制作 DiI 库存解决方案，并存储在 -20 °C。 以浓度为 4μg/μl 的 0.3 M 蔗糖/PBS 准备工作解决方案。 使用口管吸吸，在 0.3 M 蔗糖/PBS 中吸入 5 – 10 μl 的 DiI。较老的胚胎可能需要高达25微升或更多。从E8.5开始，胚胎有更大、更肌肉的静脉，可能需要用杜蒙#5保持位置，然后用装有DiI的玻璃针刺住。 迅速将针头插入静脉，用口管稳定地吹，使 DiI 能够缓慢地加入血液流动，而不会形成血块。或者，使用压力喷油器进行 DiI 交付。 8. 分段或全山检查的收获胚胎 为了在胚胎内保留尽可能多的DiI，注射后立即收获胚胎，将其铲入穿孔的勺子上，用一把直剪刀切割血管和结缔组织，将胚胎从蛋黄中解放出来。 取出任何松散的膜，解剖出感兴趣的器官（即本教程中的肺和消化道），非常小心不要压缩组织，这会产生DiI的扩散。立即修复组织浸入4%PFA 1-2小时在RT。 在 PBS 中冲洗组织 5 分钟，然后在含有 5μg/ml DAPI 的 PBS 中冲洗 15 分钟。将样品安装在桥接显微镜滑梯上进行整个安装检查或嵌入样本进行低温剖面。