문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소
Summary
이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.
Abstract
포유 동물의 난소는 난포로 구성되어, 체세포 과립 세포에 의해 둘러싸여 하나의 난자로 구성된 각각의 뿌리는, 기저막 내에서 함께 동봉. 여포의 유한 풀은 감수 체포에 난자가 원시 난포를 형성, 평탄화 된 과립 막 세포와 긴밀한 관계를 형성 배아 발달 동안에 규정된다. 또는 출생 직후, 포유류의 난소 지점은 이후 성장 난포 풀에 난포의 꾸준한 출시가있는 원시 난포의 수명의 공급을 포함.
난소는 난포 문화에 매우 생리적으로 성장하여, 체외에서 개발에 특히 의무입니다. 이 작품은 원시 난포를 포함하는 전체 신생아 난소의 문화, 개인 난포의 문화, preovu까지 미성숙에서 난포의 개발을 지원할 수있는 방법을 설명latory 단계는, 이후 자신의 난자는 체외에서 수정을받을 수 있습니다. 여기에 설명 된 작품은 난소 외부 화합물에 노출에 의해 영향을받는 방법을 결정하기 위해 문화 시스템을 사용합니다. 또한 성장 여포 및 여포 원시의 비 성장 풀 간의 상호 작용의 발생 수를 조사 공존 배양 시스템을 설명한다.
Introduction
포유 동물의 난소는 난자의 여성의 일생 공급, 난포에 포함 된 각 구성되어있다. 모공이 휴식에 이전 출생에 형성되고, 원시 단계 : 뿌리 풀이 설정되면, 성장 난포 풀에 원시에서 난포의 지속적인 점진적인 움직임이있다. 난포가 성장하기 시작하면 그들은 배란, 또는 Graafian, 단계에 도달 할 때까지, 그들은 1 차, 2 차 전동 난포하고 전 정부 단계를 통해 개발할 수 있습니다. 배란 난포에서 난자 만이 수정 된 경우, 용어 배아 발달을 지원할 수 전체 개발 능력을 보유하고 있습니다.
난소 긴 체외에서 높은 생리 방식으로 개발하는 것으로 알려져있다. 이는 그 안에 미성숙 단계로부터 난자를 t까지 (있는 그것의 감수 분열을 완료 할 수없는 점)을 지원하기 위해 필요한 셀을 포함하는 각 난소 여포 될 가능성그는 유능한 발달 단계 (있는 완전히 감수 분열, 수정 및 기간에 생성 된 배아 발달의 완료를 지원할 수있는 포인트).
생체 외 난소 개발 생리 특성상 난소 배양 기술이 널리 적용되고있다. 따라서, 체외 방법 (예를 들어 그 다낭성 난소 증후군, 다낭성 난소 증후군의), 화학 물질에 대한 노출에 의해 영향을 받는지 난소 / 난 모세포의 검사, 또한 실용적인 목적으로 난소 개발, 난소 병리의 조절을 조사하기 위해 사용되어왔다 원시 난포에서 fertilizable 난자를 얻을 수있다. 인간을 비롯한 대형 포유류에서 모낭을 이용한 배양 기술이 최근 몇 년 동안 상당히 개선 2,3- 않았지만 현재까지, 후자는 단지 마우스 난소 조직 하나를 사용하여 달성되었다.
우리는 여기에 마우스 난소 조직을 사용하여 여러 문화 방법을 설명합니다. 첫 번째 방식 운전 방식D는 전체 신생아 마우스 난소를 사용하고, 원시 난포 (4)의 형성과 초기 개발을 지원합니다. 두 번째 시스템은 배란 전 단계에 후반 전동 난포에서 개별 그대로 난포의 성장을 지원합니다 이 기술을 사용, 모공 개별적으로 배양, 또는 쌍 5,6에서 할 수있다. 마지막으로, 우리는 원시 성장 및 난포 (7) 사이의 상호 작용의 조사를 허용하는 방식으로 제 두 가지 기술을 조합, 공존 배양 시스템을 설명한다.
개별 그대로 난포의 문화 매체 분석 난포 / 난소 호르몬 생산의 조사를 허용하면서 난포 성장, 문화 기간 동안 매일 뿌리 측정에서 측정 할 수 있습니다. 또한, 조직 학적 분석 / 또는 면역 조직 학적 분석을 구하는 예에 대한 후속 처리를 위해, 배양의 마지막에 모낭 또는 난소 조직의 수집에 의해 달성 될 수있다의 mRNA 또는 단백질.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 판매용 초기 난포 단계, 개별 전동 난포 난포 두 조직의 공동 배양 물을 함유하는 전체 신생아 난소하여 시험 관내 마우스 난포의 개발을 지원하는 데에 이용 될 수있는 다양한 배양 시스템을 설명한다.
신생아 마우스 난소의 문화는 조기 난소 개발, 보조 뿌리 단계까지 특히 난포 성장의 개시를 지원합니다. 신생아 마우스의 연령의 범위는 관심의 발달 단계에 따라, 이러한 문화 사용할 수 있습니다. 난소 신생아 쥐에서 얻은 경우, 여포 형성이 진행하지만 아직 완료됩니다 : 문화는 적어도 부분적으로 난포 성장에 따라 계속 여포 형성을 지원합니다. 또한, 시대의 네 – 투 – 오일 주위 마우스의 난소의 사용은 원시 성장 폴리 더 많은 수의 문화의 결과 (있는 시간 여포 형성은 이미 완료입니다)사이클 사용 (12). 여기에 설명 된 특정 기술의 유리한 측면은 혈청 정의되지 않은 첨가제를 전혀 사용하지 않는, 오직 αMEM 및 BSA 이루어진 매우 기본적인 매체에 큰 조직의 산소화 및 배양을 허용 부동 폴리 카보네이트 멤브레인의 사용을 포함한다. 전체 난소의 문화는 배양 된 신생아 난소 1 난포 과립 막 세포 복합체의 해부와 같은 기술의 변화를 필요로 후속 개발, 보조 뿌리 단계를 넘어 개발을 지원하지 않는 것 같습니다.
난포 개발의 후기 단계는 입체 구조를 유지하면서 배양 배란 단계로 성장 될 수있는 개별 그대로 늦은 예비 난포를 밖으로 해부하여 시험 관내에서 개발 될 수있다. 생체 내에서 발생할 때,이 배양 기법을위한 모낭 손상의 사용은 상이한 모낭 컴포넌트 간의 관계를 유지한다. 티S 배양 시스템은 후속 수정 및 배아 발달을 지원할 수 난자를 얻기 위해 사용될 수있다.
Fertilizable 난자는 난자 – 과립 막 세포 복합체 한 체외에서 배양하는 동안, 제 2 단계이어서 여기에 설명 된 많은 배양 개시 프로토콜을 사용하여 마우스의 난소로부터 신생아를 얻을 수있다. 상당히 자주 오늘날 사용되는 다른 시스템이 지원을 제공하기 알지네이트 하이드로 겔 같은 물질로 캡슐화 된 모낭 또는 난소 조직의 문화, 포함 (예를 들어, 참조, Tagler 등. 13). 방법 개발의 초점의 대부분은 현재 인간을 포함한 다양한 종으로부터 원시 낭에서 fertilisable 난자를 얻는 장기 목표로 난소 큰 포유류 모낭 배양을위한 기술을 개선하는 것이다.
어느 경우든지, 포유류 난소 interactio와, 발생 단계의 범위에 포함되어 모공자신의 규제에 영향을 미치는 모공 사이 NS. 난소 기능의 이러한 측면은 제대로 이해하고 어려운 생체 내에서 검사. 여기에서 설명하는 마지막 방법은 체외에서 모낭의 다른 단계의 개발을 지원하기 위해 공동 문화 시스템을 사용합니다. 필요한 경우, 하나 또는 둘 모두 이전에 조직의 공동 배양 생체 내 또는 시험관 내에서 사전 처리 될 수있다. 이와 같은 공동 문화 시스템은 성장하는 방법을 예를 들어, 난포 난포의 상호 작용을 조사하기에 이상적인 방법을 제공, 난포가 원시 난포 풀에 영향을 미치는 어려운 입증 난소 생물학의 측면은 지금까지 조사합니다.
조심 절개가 우발적 조직 손상을 방지하기 위해 요구되지만 전체 난소 배양 기술은 매우 간단하다. 개별 모낭의 해부 오른쪽 단계에서 난포가 난소 손상 및 손상으로부터 해부하기 전에 반복 연습을 필요로하는 전문 기술이다. 그것은 중요하다조심스럽게 개별 모낭을 해부하거나, 해부 프로토콜 중에 발생한 손상은 이후 문화 기간 동안 여포 사망을 초래할 수 있습니다. 조직 배양 처리 plasticware에 사용하는 경우, 모낭은 첨부 것이다 여포가 마이크로 타이 터 플레이트의 웰에 직접 배치되는 경우, 그것은 플라스틱에 thecal 셀 아래 도금 최소화하기 위하여, 단지 비 – 조직 배양 처리 된 플라스틱을 사용하는 것이 중요 잘베이스와 파열 그들은 성장. 모든 공 배양 작업, 조직은 서로 직접 접촉하도록 배치되어야한다.
모낭 배양 기술에 사용하기 위해 위에서 설명한 매체는 마우스 혈청의 추가를 포함한다. 그것은 소 태아 혈청과 마우스 혈청을 교체 할 수 있지만, 일괄 테스트가 적당한 공급원을 식별하기 위해 필요한 그러한 혈청 가끔 일괄 완전히 배란 여포 스테이지 개발을 지원한다. 난포 자극 호르몬 (FSH)의 배치 시험은 국제 유니으로도 좋습니다FSH는 생체 외에서 모낭 성장에만 대충 상관성을 평가한다하는 TS. 난포 파열 정기적으로 문화 기간 동안 발생하는 경우, 신선한 배치와 스톡 아스 코르 빈산 교체를 고려.
기술, 해부 현미경 및 조직 배양 인큐베이터 이외 특히 특수 장비를 필요로하지 않는 층류 후드 양호한 무균 기술의 사용은 난소가 여기에 설명 된 방법에서와 같이, 항생제의 부재 하에서 배양 될 수 있지만. 이것은 그들이 다음 기름지게 배양 할 경우 특히 난자에 항생제의 잠재적 인 악영향을 방지하기 위해 유용 할 수있다. 이 무균 환경에서 작동 할 수없는 곳에는 해부와 문화 매체에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by MRC grant G1002118.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
| αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
| Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
| FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
| Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
| Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
| Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
| Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
| Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
| 24 well plate | Greiner | 662160 | |
| 96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| 96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
| Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
| Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
| Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
| Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
| Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
| Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
| 1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |
References
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