Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Spettroscopia a forza atomica è uno strumento ideale per lo studio di molecole a superfici e interfacce. Un protocollo sperimentale per accoppiare una grande varietà di singole molecole covalentemente su una punta AFM è presentato. Allo stesso tempo, la punta AFM viene passivato per evitare interazioni aspecifiche tra la punta e il substrato, che è un prerequisito per studiare singole molecole allegate alla punta AFM. Le analisi per determinare la forza di adesione, la lunghezza di adesione, e l'energia libera di queste molecole su superfici solide e bio-interfacce sono poco presentati e sono forniti riferimenti esterni per ulteriori letture. Molecole esempio sono le polytyrosine poli (aminoacidi), il polimero trapianto PI- g -PS e fosfolipidi PAPA (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina). Queste molecole sono desorbiti da superfici diverse come CH 3 -SAMs, idrogeno terminato diamante e supportati doppi strati lipidici in varie condizioni di solvente. Infine, lavantaggi di forza spettroscopiche esperimenti di singola molecola sono discussi tra cui mezzi per decidere se veramente una singola molecola è stato studiato nell'esperimento.
Introduction
Negli ultimi 30 anni, microscopia a forza atomica (AFM) è risultato essere una tecnica di imaging prezioso per studiare biologici 1,2 e 3 sintetici materiali e superfici in quanto fornisce una risoluzione spaziale molecolare in tre dimensioni e può essere azionato in vari solventi ambienti. Inoltre, la spettroscopia di forza molecola AFM-single (SMFS) permette di misurare le forze che vanno dal PN μN regime e ha dato una visibilità senza precedenti, ad esempio in proteine pieghevole 4,5, polimero fisica 6-8, e singola interazione molecola-superficie 9 – 12 .La logica studiare singole molecole, piuttosto che un insieme di molecole è quello di evitare gli effetti che spesso mascherano rari eventi o stati molecolari nascosti media. Inoltre, un gran numero di parametri molecolari, quali la lunghezza del profilo, la lunghezza Kuhn, l'energia libera di adesione, ecc può essereottenuto. Questa procedura è descritta negli esempi che seguono. In un tipico esperimento AFM-SMFS, la molecola sonda è accoppiato ad una punta molto affilata tramite una molecola linker. La punta sé è situato alla fine di un cantilever pieghevole. Se la punta viene portato a contatto con la superficie della molecola sonda interagire con questa superficie. Osservando la deflessione del cantilever su retrazione della punta, la forza, e quindi l'energia libera, per staccare la molecola dalla superficie può essere determinato. Per ottenere statistiche significative, un gran numero di cosiddetti curve forza-distanza devono essere acquisiti. Inoltre, per avere veri esperimenti singola molecola (cioè, utilizzando una stessa molecola di sonda per la durata di tutto l'esperimento) la molecola sonda deve essere accoppiato covalentemente alla punta AFM. Qui, un protocollo sperimentale per cantilever funzionalizzazione con una singola molecola mediante un legame covalente è presentato. La singola molecola può o essere accoppiato tramite un amino o tioGruppo L alla punta AFM. Il processo di coniugazione può essere effettuata in una grande varietà di solventi (organici e acquosi) per spiegare le proprietà di solvatazione dei polimeri utilizzati.
Nella prima parte, un protocollo generale per attaccare covalentemente una singola molecola ("probe molecola") tramite una molecola linker di una punta AFM descritto. A tal fine, NHS- organico o maleimmide-chimica viene utilizzato 13. Insieme con il protocollo per tre molecole esempio, i processi di acquisizione dati e di analisi dei dati sono descritti e sono forniti i riferimenti per ulteriori letture. Le molecole di esempio sono: il (lineare) tirosina polimero, il polimero trapianto PI- g -PS e il papa lipidi. Questo include lievi variazioni del protocollo, per esempio per collegare covalentemente cisteine. Inoltre, una sezione dedicata alla preparazione di superfici differenti come superficie diamantata, un CH 3 -self-assemblato monostrato e bistrati lipidici. Queste interfacce hanno provit di essere buone referenze ed esempi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel corso degli ultimi decenni, gli esperimenti di singola molecola hanno fornito intuizioni senza precedenti nei meccanismi molecolari e si è rivelato essere un approccio inestimabile nella vita della scienza e non solo. Per ottenere buone statistiche e significative da esperimenti SMF, idealmente una stessa molecola viene utilizzato su tutto il corso dell'esperimento. In contrasto con esperimenti con insiemi di molecole, esperimenti SMFS sono in grado di rilevare eventi rari e stati molecolari nascosti. Un altro …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
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