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의학

Em Enriquecimento vitro de câncer de ovário de iniciação Células Tumorais

Published: February 18, 2015
doi:
10.3791/52446
, ,
1Women’s Malignancies Branch,National Cancer Institute

Summary

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Abstract

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

Introduction

O câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal nos Estados Unidos com a maior causa de morbidade e mortalidade, sendo os recursos quimiorresistentes altamente recorrentes da doença. O tratamento primário geralmente compreende cirurgia cytoreductive máxima e terapia baseada em platina subseqüente, embora haja alguns indícios que sugerem terapia neoadjuvante pode ser benéfico em alguns casos um. A maioria dos pacientes respondem favoravelmente ao tratamento primário, mas, infelizmente, metade vai recaída no prazo de 18 meses 2.

A maioria dos tumores malignos de ovário são carcinomas epiteliais e pode ter origem no epitélio da superfície do tubo de 3,4 ovário ou de Falópio. Vários estudos suportam a existência de células-tronco somáticas no sistema reprodutivo feminino que, presumivelmente, ajudar na reparação de tecidos que é necessário após a ovulação 5,6. A atividade proliferativa alta tanto no ovário e trompa de Falópio durante ovulção pode ser um fator importante no desenvolvimento do câncer de ovário (Gharwan, et al. manuscrito submetido). A derivação de células formadoras de tumor não é clara, mas pode surgir a partir de células estaminais normais, células progenitoras, células diferenciadas, ou através de mutações que os tornam incapazes de regular a divisão ou o destino. Estas células também têm sido chamadas de "células-tronco cancerosas", ou "células iniciadoras de câncer", e pode crescer em tumorigênicos, esferóides multicelulares em condições de pouca fixação. Embora o modelo hierárquico de desenvolvimento TIC pode ser dinâmico, TICs não compartilham muitos dos mesmos recursos que as células-tronco normais, incluindo quietude, a resistência à quimioterapia, a longo prazo de auto-renovação e capacidade de se diferenciar em várias linhagens de células 7,8.

Vários estudos sustentam a existência de TICs no câncer de ovário e os esforços atuais estão em andamento para esclarecer o mecanismo (s) pelo qual essas células apoiar tumorigenesis 9-11. Vários marcadores têm sido propostos para identificar TIC ovarianos com tumorigenicidade aumentada incluindo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, e MyD88, embora a contribuição exacta de cada marcador é clara e pode ser do tipo celular específico de 11-16. Enquanto um marcador universal ou conjunto de marcadores não tenha sido inequivocamente estabelecida para TIC ovarianos, diferentes grupos isolaram TIC ovarianos mais vulgarmente por selecção de CD44 +, CD133 + e / ou células com alta aldeído desidrogenase (ALDH) actividade 13,17-21. CD44 é uma glicoproteína transmembranar que actua como um receptor de ácido hialurónico e regula vários processos importantes para a progressão tumoral, incluindo adesão, proliferação, migração, angiogénese e diferenciação 22. CD133 é uma glicoproteína transmembranar cuja função ainda não está claro, mas estudos sugerem que organiza topologia membrana plasmática 23. ALDH, uma enzima intracelular que catalisa a oxidação de aldeídos, pode ser a mais Universai marcador de tiques como elevada actividade tem sido identificada em células estaminais isolado a partir de uma variedade de tecidos e várias funções têm sido atribuídas a ALDH no apoio células estaminais normais e tiques 24. A partir de agora, CD133 e ALDH1 parecem ser os marcadores mais reproduzíveis de TICs ovário 13,21.

Para além de compreender as características dos tiques, há também um grande esforço para identificar drogas que visam especificamente esta subpopulação. A alta taxa de recaída associada com o cancro do ovário pode ser devido a uma falha de quimioterapias actuais para erradicar com sucesso TIC. Embora a massa do tumor é susceptível às terapias existentes, tiques são pensados ​​para ser resistente e com uma densidade indetectáveis ​​através de métodos padrão. Elucidar mecanismos de resistência a terapia e recidiva tumoral são vitais para melhorar a resposta e taxa de sobrevida de pacientes com câncer de ovário.

Aqui, as técnicas de cultura são descritas thno enriquecimento em TICs de linhas celulares de cancro do ovário estabelecidos e primários. As condições de cultura aqui descritos têm sido utilizados por vários grupos para induzir a propagação de células de tiques ou esferóides com qualidades de células estaminais 11,12,14,16,20. Embora existam vários meios de cultura de células-tronco e suplementos comumente utilizados para o enriquecimento de TIC / esferóides foi utilizada uma fórmula de meio isento de soro com EGF e FGF, mas sem a adição de B27 ou N-2 suplementos. Estes suplementos, vulgarmente utilizados para a cultura de células neuronais e de enriquecimento para células estaminais, têm sido mostrados para promover um fenótipo mesenquimal 25,26 e continua a haver alguma incerteza no campo quanto ao facto de TIC com um mesenquimatosas ou epiteliais fenótipo tumorigénico 27-29 são mais . Para minimizar incertezas e variáveis, optamos por usar a fórmula mais comum, uma vez que estamos lidando com células câncer epitelial de ovário.

A manutenção de células em meio isento de soro num balão de fixação baixofacilita a formação esferóide e apoia a propagação de células com expressão de CD133 e alta atividade ALDH. Nosso trabalho ainda mostrou que as células flutuantes em condições normais aderentes também pode representar uma população TIC mais tumorigenic. A injecção de células cultivadas nestas condições em ratinhos nus atímicos leva a um maior potencial tumorigénico em comparação com células cultivadas em condições associadas na presença de soro. Muita informação sobre o papel de TICs na iniciação do câncer de ovário, progressão, resposta terapêutica, e recidiva da doença pode ser adquirida através do uso destas técnicas.

Protocol

1. Cultura Tradicional de linhas celulares de cancro do ovário (Condições aderentes) NOTA: Toda a manipulação de células e meios de comunicação deve ocorrer em uma cultura capa de tecido estéril Preparar meios de cultura celular tradicional. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + HEPES 15 mM) e suplementar com soro bovino fetal inactivado pelo calor 10% e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar a solução através de 0,45 um filtro de vácuo. Prepare um poliestireno 75 centímetros balão tradicional cultura 2 tecido etiquetada com o nome, data e número de passagem da linha de células de interest.Remove o frasco de células de ultra baixa congelador ou nitrogênio líquido. Descongelar colocando em 37 ° C num banho de água durante 5 minutos. Transferência da suspensão frasco para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3 ml de meio de cultura celular tradicional (preparado acima). Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. Enquanto isso, adicione 16 ml de mídia tradicionais de cultura de células, no balão. Aspirar o sobrenadante. Usando 2 ml de cultura de células células pipet mídia tradicional cima e para baixo para soltar pellet e suspensão de transferência, no balão. Suavemente balão de rocha para distribuir uniformemente balão cells.Place incubadora humidificada em cultura de células definido para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar células diariamente até 80% de confluência é atingido. Uma vez que as células estão 80% confluentes dividir a cultura 1: 2 no capuz de cultura de células. Aspirar o sobrenadante e lava-se com solução salina tamponada com fosfato quente (sem cálcio e magnésio) (PBS). Adicionar 1,5 ml de tripsina a 0,25% -EDTA e incubar 3-5 min a RT. Prepare duas novas poliestireno 75 centímetros 2 frascos e adicione 16 ml meio de cultura celular tradicional a cada balão. Ressuspender as células tripsinizadas em 4 ml de meio de cultura celular tradicional e aliquotas de volumes iguais de cada um dos novos frascos. Colocar em frascos de cultura de células incubadora humidificada ajustado para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar células diariamente até 80% de confluência é atingido. Continue a dividir células ecultura ou congelar e armazenar a -80 ou em nitrogênio líquido. 2. Geração de multicelular Spheroids de linhas celulares do cancro do ovário, utilizando células flutuantes ou aderentes NOTA: Toda a manipulação de células e meios de comunicação devem ter lugar num estéril capa de cultura de tecidos. Após cultura linhas celulares sob métodos de cultura tradicionais para 2-3 passagens (seção 1) prosseguir com as seguintes etapas. Prepare a mídia de células-tronco. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + HEPES 15 mM) e completar com 1% de penicilina / estreptomicina (para uma concentração final de 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), 1% de substituição de soro nocaute , 0,4% de albumina de soro bovino e 0,1% de insulina-transferrina-selénio. Filtrar a solução através de 0,45 um filtro de vácuo. Meios de células estaminais suplemento com o factor humano recombinante de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico humano recombinante (FGF) para uma concentração final de 20 ng / ml e 10 ng / ml, respectivamente. NOTA: Os fatores de crescimento deve ser adicionado fresco para os meios de comunicação de células-tronco para a direita antes de usar. Criar cultura floater TIC. Remover balão de 80% de células confluentes cultivadas em condições de cultura tradicionais aderentes. Recolha mídia e todas as células flutuantes (individuais e agregados), deixando a população aderente para trás, e transferir para 50 ml de polipropileno tubo de centrífuga. Centrifugar a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. NOTA: as células flutuantes e agregados são aparentes 24-72 horas após as células aderentes são ligados ao balão sob cultura tradicional. A partir de uma recuperação de 80% da placa confluente de cerca de 1.0 – 5.0 x 10 5 células viáveis ​​flutuantes pode ser esperado, dependendo da linha celular. Neste estudo, o número médio de células flutuantes recolhidas a partir de uma cultura confluente em aderente 80% foi de: 5,0 x 10 5 por ACI-23, 4,8 x 10 5 para OVCAR5, 3,5 x 10 5 para CAOV3, e 1,0 x 10 5 para TGS- 3. Com a transferência, multicellformação esferóide ular em cultura tradicional e TIC floater ocorre em poucos dias embora isto seja um pouco dependente da linha celular. Por exemplo, ACI-23 células formam agregados mais facilmente do que as células CAOV3. Enquanto isso, prepare um baixo apego superfície de poliestireno 75 centímetros 2 frasco de ultra cultura de tecidos etiquetada com o nome, data e número de passagens de linha celular. Adicionar 10 ml de meio de células estaminais suplementado com factores de crescimento para o balão. Depois de centrifugação for concluída, a mídia aspirado e transferência de pellet para balão de baixo apego pela adição de 6 ml tronco media celulares e pipetando para cima e para baixo para soltar pellet. Colocar em frascos de cultura de células incubadora humidificada ajustado para 37 ° C e 5% de CO 2. Monitorar as células a cada 2-3 dias para observar a formação esferóide. Criar cultura TIC tradicional. Remover balão de 80% de células confluentes cultivadas em condições de cultura tradicionais aderentes. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 1,5 ml de tripsina a 0,25% de EDTA e incubar 3-5min à temperatura ambiente. Prepare um baixo apego superfície de poliestireno 75 centímetros 2 frasco de ultra cultura de tecidos etiquetada com o nome, data e número de passagens de linha celular. Adicionar 10 ml de meio de células estaminais, suplementado com EGF e FGF, como descrito, para o frasco. Adiciona-se 6 ml de células estaminais meios para o balão com a tripsina. Solução de células Pipet cima e para baixo e tentar soltar as células da superfície do frasco. Transferir volume inteiro de células de ultra baixa balão anexo contendo os 10 ml tronco media celular. Colocar o balão em humidificada incubadora de cultura de células definido para 37 ° C e 5% de CO 2. Suplemento culturas TIC cada 48-72 horas, com um adicional de 2 ml de meio de células estaminais e de EGF e FGF fresco para uma concentração final de 20 ng / ml e 10 ng / ml, respectivamente. Monitorizar as células até 60-80% de confluência é atingido. Culturas divididas por colocar volumes iguais em dois novos frascos de ultra baixo de fixação e adição de mídia de células-tronco frescos para atingir um volume final de 18 ml. Alternativaly, centrífuga toda a suspensão a 4 ° C durante 5 minutos a 400 x g. Suspenda as células em meios de células-tronco suplementado com EGF e FGF e distribuir igualmente em novos frascos ultra-baixo de fixação. Células não tem que ser dissociados em suspensões de células individuais para passagem em. NOTA: Neste ponto, as culturas podem continuar a ser dividida e culta, congelados, ou experimentalmente manipulado para análise. A 60 – 80% de confluência as seguintes concentrações de células foram recuperadas por ACI-23: 8,0 x 10 6 para tradicional aderente, 4,0 x 10 6 para tradicional TIC, e 5,0 x 10 6 para culturas Flutuador TIC. Embora possa ser a linha celular dependente, verificou-se que de 5 – 10 dias em cultura é óptima para TIC enriquecimento como a percentagem de CD133 + ALDH + células é baixo durante os primeiros 3 dias, picos em 5-10 dias e diminui novamente em 14 dias. 3. Geração de primária do cancro do ovário epitelial linhas celulares e multicelulares Spheroidsa partir de ascite do paciente resistente à quimioterapia NOTA: aprovação Institutional Review Board foi obtido para esse protocolo. Toda a manipulação de células e meios de comunicação devem ter lugar num estéril capa de cultura de tecidos. Placa de fluido de ascite 1: 1 com meio de cultura celular tradicional. Prepare mídia, como descrito na seção 1 e adicione 10 ml de vários frascos de poliestireno 75 cm 2 de cultura de tecidos tradicionais. Fluido ascite é normalmente fornecido em 1 L garrafas de vácuo estéril; retire a tampa de vácuo. Adicionar cuidadosamente 10 ml ascite fluido ao balão contendo 10 ml de mídia tradicional e colocar em umidificado incubadora de cultura de células definidas para 37 ° C e 5% de CO 2. Deixe em repouso por 72-96 horas, antes de fazer uma mudança de mídia completo. Mudança de mídia a cada 2-3 dias até que as células atingem 60-80% de confluência Uma vez que as células atingem 60-80% de confluência, divididas 1: 2, conforme descrito na Seção 1. culturas Iniciar TIC como descrito na seção 2. NOTA: Os eritrócitos presentes no ascites será removido após a primeira mudança de mídia como eles são não-aderente. Quaisquer fibroblastos presentes será em grande parte removido após o tratamento com tripsina como eles são mais sensíveis e vai levantar com exposição mínima a tripsina. Pureza de células de cancro do ovário foi determinada por análise de citometria de fluxo utilizando o anticorpo para o CA-125 (MUC16). 4. coloração de células para a confirmação de Citometria de Fluxo de TIC Markers Recolha culturas TIC. Transferir o conteúdo do frasco em polipropileno de 50 ml tubo de centrífuga. As suspensões de centrifugação durante 5 minutos a 400 x g. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 2 ml de solução de dissociação de células não enzimática, incubar 3-5 min a 37 ° C, e pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados e dissociar-se em células individuais. Adicionar 4 ml de meio de células estaminais. Recolha culturas aderentes. Media Aspirar e lavar com água morna PBS. Adicionar 3 ml de solução de dissociação de células não enzimática e incubar 3-5 min a 37 ° C. Adicione 3 ml de células tradicionalmeios de cultura e pipetar cima e para baixo várias vezes para retirar células da garrafa e recolher em tubo de centrífuga. Centrifugar tanto TIC e suspensões aderentes durante 5 minutos a 400 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cada 1 ml de PBS contendo 3% de soro fetal bovino. Incubar à temperatura ambiente 30 min. Enquanto isso, contar o número de células viáveis ​​utilizando azul de tripan. Observar as células ao microscópio para confirmar esferóides são dissociados em células individuais. Etiqueta 5 x 1,5 ml Eppendorf tubos para cada uma das seguintes condições de cultura: 1) Unstained (controle unstained de indemnização), 2) ALDH (controle única mancha positivo para compensação), 3) CD133 (controle positivo única mancha de indemnização), 4 ) ALDH + CD133 (amostra de teste experimental), e 5) DEAB ALDH + (controlos negativos para a fluorescência de fundo em FL-1 e FL-4 canais, respectivamente). Distribuir aproximadamente 5 x 10 5 células cada, para tubos # 1 – 4. Centrifugue as suspensões durante 5 min a 400 x g. Aspirar supernatant e ressuspender pelotas em 500 ul ALDEFLUOR Tampão de Ensaio. Adicionar 10 DEAB ul (inibidor de ALDH) para tubo # 5 para controle experimental negativo. Adicionar 5 mL ativados reagente ALDEFLUOR para tubo # 2 para controle positivo compensação e pressione levemente para misturar. Adicionar 5 mL ativados reagente ALDEFLUOR para tubo # 4 para análise experimental. Flick tubo para misturar e transferir imediatamente a metade do volume de células a partir de tubo no tubo # 4 # 5 (250 ul), que contém o DEAB. Tubos Flick para misturar bem. Incubar todos os tubos para 30 – 45 min a 37 ° C protegido da luz. Tubos Flick meio período de incubação como células vão se depositar no fundo. Centrifugar todos os tubos durante 5 min a 400 x g. Células sobrenadante e ressuspender Aspirar em 500 ul ALDEFLUOR Tampão de Ensaio. Para tubos com coloração CD133 (# 3 e # 4), adicione-CD133 APC 01:11 diretamente em tampão de ensaio ALDEFLUOR. Incubar 15 minutos em gelo ao abrigo da luz. Tubos de centrífuga de CD133 para 5 min a 400 x g. Lavar uma vez com500 ul de tampão de ensaio ALDEFLUOR. Ressuspender as células em tampão de ensaio ALDEFLUOR 500 ul, respectivamente. Filtro de suspensões em poliestireno indivíduo rodada tubos de fundo com tampa de filtro de células. Assegure-se que todo o volume é filtrada através da tampa. Utilizar um citómetro de fluxo para analisar a população de células. Use tubos # 1-3 para a configuração dos controles de compensação. Usando a frente e parâmetros lado de dispersão, porta das células, tendo a certeza de excluir detritos celulares. Estabelecer células duplas usando FL-1 e FL-4 canais, respectivamente ALDH + e CD133 +. Usando um programa de análise de citometria de, confirmar as condições de cultura aumentou a percentagem de células TIC como as culturas ricas em TIC deve ter coloração mais elevada para estes dois marcadores. NOTA: Para além CD133 e de ALDH, outros TIC markersof cancro do ovário pode ser analisada com o número de marcadores utilizados em qualquer amostra dependem das capacidades de citómetro de fluxo. 5. in vivo </em> subcutâneas Injeções para Confirmar Tumorigenicidade de populações de células NOTA: aprovação Institutional Review Board foi obtido para esse protocolo. Distribuir atímicos ratinhos nus fêmea 6 – 8 semanas de idade em grupos experimentais em gaiolas de 3 e permitir a aclimatar durante alguns dias antes das injecções. Siga os ratos sob diretrizes experimentais humanas como por NIH Animal Care e do Comitê Use; monitorar o peso do corpo, a aparência física, incluindo a perda de peso ou ganho superior a 20%, a aparência emaciada, diarreia ou dermatite e eutanásia camundongos enquadrem nestes critérios por CO 2 asfixia. Recolha culturas como descrito na seção 2. Ressuspender cada população de células em 1 ml de PBS. Contagem de células viáveis ​​utilizando trypan ensaio azul. Prepare 15 ml tubos de centrífuga. Para triplicado medidas adicionar 1,5 x 10 6 células viáveis ​​diluído em 2 ml de PBS em cada tubo (5 x 10 5 células em um volume de 0,5 ml por via subcutânea será injectado no direito fescorridos de cada mouse). Preparar 0,5 ml de PBS apenas para os ratinhos de controlo. Utilizando agulhas 27 G, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspensão de células a partir de culturas aderentes, as culturas tradicionais TIC tradicionais, floater culturas TIC, ou PBS no flanco direito de cada um dos três ratinhos por grupo. Retorno ratos para o gaiolas originais após a injecção. Pesar ratos e medir eventuais tumores palpáveis ​​em duas dimensões duas vezes weeklyby Vernier caliper, estabelecendo comprimento e largura. NOTA: tempo de latência do tumor é geralmente 20 – 50 dias, dependendo da linha celular. Calcular o volume do tumor molhada através de métodos padrão (V = (largura) 2 x comprimento / 2). NOTA: Embora este estudo comparou tumorigenicity de TICs contra células aderentes para a primeira geração apenas, in vivo passagens em série de TICs cultivados em condições semelhantes foi completado por outros 11,20.

Representative Results

Estabelecido linhas celulares de cancro do ovário e uma linha de células de ascite primário cultivadas em condições de cultura aderentes tradicionais, na presença de soro anexos mostram, a morfologia de paralelepípedos, enquanto que as mesmas células cultivadas em condições de cultura de TIC exibem morfologia flutuante esferóide, comuns em populações de TIC. Imagens Brightfield exibidos na Figura 1 A mostra claramente as diferenças morfológicas nas condições de cultura. A Figura 1B mostra as morfologias diferenciadas alcançados após repique os ACI-23 e TGS-3 culturas TIC em condições aderentes tradicionais. Apenas 24 horas após a sementeira de volta em condições aderentes, a maioria dos esferóides multicelulares dissociam-se e aderem à superfície, assemelhando-se as células aderentes típicos. Para verificar se as condições de TIC para enriquecer células com marcadores de células tronco citometria de fluxo foi realizada utilizando dois marcadores comuns de TICs ovarianos – CD133 expression e actividade de ALDH. Os gráficos de pontos mostrado na Figura 2 A destacar o aumento da percentagem de células CD133 + em baixo fixação, condições isentas de soro. Do mesmo modo, a actividade da enzima é mais elevada ALDH nestas condições em comparação com as condições tradicionais de cultura aderentes. Embora as culturas aderentes tradicionais contêm células CD133 +, os aumentos percentuais em condições que aumentam a formação esferóide. Análise de um marcador de pluripotência, TRA-1-60, presta um apoio adicional de que as condições de TIC para enriquecer TICs, Figura 2 B. Quantificação na Figura 2 C demonstra que a dupla positivos (CD133 + ALDH +) ACI-23 células são em grande parte limitada a culturas cultivadas sob condições que reforcem TIC. Alterações nos níveis de proteínas de diferentes fatores de transcrição que ocorrem nas células ACI-23 após cinco dias de cultura nas condições de TIC também foram examinados. Um aumento progressivo em cada um dos marcadoress é visto desde o tradicional ao floater condições TIC em comparação com os níveis relativamente baixos verificados na cultura aderente, Figura 2 D. Curiosamente uma linha de células de ascite humano cultivado nas várias condições exibe a mais elevada fenótipo marcador sob as condições TIC tradicionais com pouca ou nenhuma coloração presentes nos flutuadores condições TIC, Figura 2E. A tumorigenicidade das condições de cultura TIC foi validado através de injecções subcutâneas de números iguais de células viáveis ​​obtidas a partir de todas as condições em coortes de ratinhos nus atimicos. A Figura 3 demonstra que ACI-23 (a, b) e OVCAR-5 (C) a partir de células culturas aderentes tradicionais foram menos tumorigénicas que as das culturas de TIC. Note-se que as culturas floater TIC produzidos tumores maiores em um período de tempo mais curto do que as culturas tradicionais TIC aderentes ou tradicionais. Estes data sugerem que até mesmo com um modesto aumento nos marcadores de TIC ovarianos, há uma alteração fenotípica dramática. No entanto, com outras linhas de células (não mostradas) as culturas tradicionais TIC foram tumorigénicas mais do que as células de cultura de TIC aderentes e flutuador tradicionais. Figura 1. esferoidal de desenvolvimento em diferentes condições de cultura. (A) estabelecido linhas celulares de cancro do ovário células primárias derivadas de ascites de doentes (TGS-3) cultivadas em frascos de fixação com baixa sem soro (ACI-23, OVCAR-5 e CAOV3) e meios de células estaminais prontamente formar esferóides multicelulares. Imagens mostram condições tradicionais de cultura aderentes manter morfologia paralelepípedos epitelial na ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 e TGS-3 células, enquanto que as mesmas células esferóides formados dentro de 96 horas em condições de TIC. A barra de escala 100? M. (B) Após a exposição 24 hràs condições tradicionais de cultura aderentes, as morfologias cultura TIC apresentam um fenótipo diferenciado assemelhando-se a morfologia aderente inicial. Bar Scale 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Baixa-fixação, condições isentas de soro, para enriquecer as células com marcadores de TIC. (A) análise de citometria de fluxo de ACI-23 células utilizando anticorpo conjugado com APC CD133 demonstra um aumento da percentagem de células CD133 + em frascos com haste de fixação de baixo sem soro meios celulares. Citometria de fluxo utilizando ALDEFLUOR mostra ensaio aumento da atividade ALDH em células cultivadas em frascos de baixo apego com media de células-tronco sem soro. Controle negativo CD133 não contém anticorpos e ALDH con negativocontrole é o substrato activado na presença do inibidor da ALDH (DEAB). (B) Análise usando conjugado com FITC TRA-1-60 anticorpo demonstra maior percentual de células TRA-1-60 + nos floater condições TIC na ACI-23 células. O controlo negativo contém nenhum anticorpo. (C) CD133 + ALDH + células são mais elevadas no TIC tradicional e floater condições TIC na linha celular ACI-23. As barras de erro: SEM, N = 6, * p <0,05. (D) Análise de Western blot mostrando aumento nos níveis de proteína de marcadores de transcrição de células-tronco no ACI-23 células cultivadas em condições de TIC para 5 dias. Os lisados ​​de células inteiras (50 ug) foram analisados ​​com GAPDH como um controlo de carga. (E) gráficos de pontos representativos de TGS-3 células ascite primários analisados ​​como em Um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "always"> Figura 3. Baixa-fixação, condições isentas de soro, o enriquecimento em células com o aumento da tumorigenicidade. (A) 5 x 10 5 viáveis ​​ACI-23 As células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos em triplicado. Os ratinhos foram pesados ​​e os tumores medidos com um compasso duas vezes por semana. A = A cultura tradicional aderente, cultura F = Floater TIC, cultura S = Tradicional TIC. * P <0,05. (B) Imagens representativas de tumores formados a partir ACI-23, depois de 25 dias, utilizando células cultivadas sob diferentes condições de cultivo. (C) 5 x 10 5 viáveis ​​OVCAR-5 células foram injetadas em ratos por via subcutânea nu atímica em triplicado e monitorados como em Um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo aqui descrito apresenta um método eficiente e consistente para enriquecer culturas de células com características de células estaminais a partir de linhas celulares de cancro do ovário estabelecidos e é aplicável a amostras primários do paciente. Este método enriquece com sucesso para TIC através de uma variedade de linhas celulares. Ele permite a identificação atempada de condições que enriquecem de TIC e / ou fenótipo tumorigenic, sem ter tempo para classificar fisicamente as TICs de não-TICs dentro da população. Deste modo, os níveis relativos de diferentes vias de sinalização pode ser avaliada para a sua contribuição para o fenótipo TIC comparando culturas aderentes tradicionais para Tic culturas, utilizando uma variedade de ensaios funcionais. Se uma população pura TIC for desejado, o isolamento pode ser facilmente conseguida por incorporação de um passo assistida por fluorescência ou magnético triagem de citometria de fluxo no protocolo.

É importante ter em mente, contudo, que a expressão do marcador TICs, tais como CD133, CD44, ou de ALDH, pode variar entre linhas celulares ou amostras mesmo do mesmo tipo do tumor do paciente. Por exemplo, descobrimos que os OVCAR-5 células têm maior expressão de CD44 em relação ao CD133, ao passo que o inverso é verdadeiro para ACI-23. É, por conseguinte, pertinente para invocar iniciação do tumor em ratinhos e análise de citometria de fluxo como definitivo presença de TIC. Seguindo este protocolo, elevada actividade de ALDH foi consistentemente observada quando as células de cancro do ovário foram cultivadas em condições de células estaminais. Curiosamente, a expressão de CD133 é consistentemente maior na ACI-23 células cultivadas em condições tradicionais de cultura de TIC, enquanto ALDH é maior em floater condições TIC. Em contrapartida, os TGS-3 células ascite primárias exibir um pequeno aumento no CD133 positividade sob floater condições de TIC, mas um notável aumento na atividade de ALDH em condições TIC tradicionais. Estes resultados destacam a heterogeneidade das células de câncer de ovário e a plasticidade comumente associado com TICs. Para apoiar ainda mais o claim que estes métodos aprimorar TICs, também foi observado o enriquecimento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 é um marcador de pluripotência e tem sido usada para identificar os carcinomas embrionários do testículo e ovário, bem como cancro da próstata TIQUES 30-32. Embora os métodos têm sido bem sucedidas com numerosas linhas celulares, é possível que as condições normais de TIC pode ser mais adequada para algumas células de cancro do ovário, enquanto que os flutuadores condições modificadas melhor enriquecimento em tiques em outras populações de células de cancro do ovário. Esta novamente ressalta a heterogeneidade esperado em ambas as linhas de células de cancro do ovário paciente derivados e estabelecidos.

Além de marcadores de superfície celular, existem vários fatores de transcrição que foram mostrados para caracterizar TICs câncer de ovário, incluindo Nanog, Sox2, Oct-4 11, embora estes marcadores não são específicos para TICs câncer de ovário e, em vez representam fatores importantes para a pluripotência das células-tronco embrionárias e difdife- 33,34. Foram examinadas as mudanças nos níveis de proteína desses fatores e descobriu que os níveis de Nanog aumentar em TIC condições de cultura, de acordo com os outros 13,35, bem como CD133, TRA-1-60, e CD117. Um marcador de células-tronco cDNA matriz humana revelou ainda um aumento na genes CD133, NANOG, Melk, e PODXL nas condições de TIC em relação às condições de aderentes tradicionais. Importante, deve-se notar que, tal como com marcadores de superfície celular, factores de transcrição associadas com tiques do ovário pode variar entre linhas celulares e amostras de pacientes.

Observou-se que as células podem ser mais tumorigénico e expressar níveis mais elevados de marcadores de células estaminais se eles são inerentemente não aderentes in vitro (isto é, células que não são facilmente anexados a uma placa aderente flutuante). Em cultura, as linhas celulares tais como ACI-23 tipicamente tem muitas células viáveis ​​flutuantes e / ou células que crescem verticalmente de uma forma tradicional sob empilhamento Condit culturaíons. Apesar de enriquecimento de sucesso de TICs a partir de células flutuantes e agregados podem ser linhas celulares aplicáveis ​​aos relativamente poucos incluindo os do presente estudo e OVCAR-3 12, os nossos resultados sugerem que isso pode representar uma população mais tumorigenic. Por isso, a colheita da população "flutuante" de células cultivadas em placas de cultura de tecidos e meios de comunicação podem servir como um método alternativo de TIC de enriquecimento, para as células que se adaptam mal aos meios de comunicação de células estaminais comercial.

A utilização dos diferentes métodos de cultura apresentados neste manuscrito permitirão o enriquecimento de populações TIC rápido e uma melhor compreensão dos factores que suporta este fenótipo de células diferentes. As aplicações atuais deste método incluem caracterização que vias de sinalização são vitais para apoiar a propagação dessa população única de células. Os resultados destes estudos vão ajudar a esclarecer os mecanismos de progressão tumoral e recaída.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor – human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E
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Ovarian CancerTumor-initiating CellsTICsIn Vitro EnrichmentSphere FormationTumorigenicityStem Cell MarkersCD133ALDHLow AttachmentSerum-free MediaGrowth FactorsAdherent CellsNon-adherent CellsFloater CellsSignaling PathwaysDrug Targeting

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).
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