טיפוח<em> Heligmosomoides Polygyrus:</em> נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים
Summary
polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה ' מחזור החיים polygyrus.
Abstract
polygyrus Heligmosomoides (שנקרא בעבר dubius Nematospiroides, וגם מכונה על ידי כמה כH. bakeri) הוא helminth עיכול שמעסיק מנגנוני המערכת החיסונית מרובים להקים זיהום כרוני בעכברים ובקירבת זיהומי helminth אנושיים נפוצים. H. polygyrus נחקר בהרחבה בתחום הרגולציה חיסונית הנגזר helminth וכבר מצא לדכא בעצמה מודלים ניסיוניים של אלרגיה ואוטואימוניות (שניהם עם מוצרים מופרשים מבודדים זיהום ופעיל). הפרוטוקול המתואר במאמר זה מתאר ניהול H. מחזור החיים polygyrus לייצור עקבי של זחלי L3, התאוששות של טפילים בוגרים, ואוסף של המוצרים שלהם ההפרשה-הפרשה (הס).
Introduction
polygyrus Heligmosomoides הוא helminth עיכול עכברי טבעי הקשור באופן הדוק לטפילי נמטודות אדם מאוד-נפוצים 1. בניגוד לדגמים אחרים, כגון נמטודות Nippostrongylus brasiliensis, ח ' polygyrus קובע באופן עקבי זיהום כרוני בעכברים כתוצאה ישירה של מנגנוני המערכת החיסונית חזקה מרובים היא מעסיקה כדי לדכא את התגובה חיסונית המארח 2.
יש polygyrus H. מחזור חיים ישיר: זחלי L3 מזהמים הם מעובדים על ידי העברת feco-שבעל-פה (או מנוהלים על ידי gavage האוראלי במעבדת ההגדרה), ואז הם נודדים לשכבת subserosal של התריסריון וencyst לפני ההחזרה ללומן המעי כ תולעים בוגרות שמונה כ ימים לאחר הדבקה ראשונית. ייצור הזדווגות והביצה מתרחש ביום 10 ואפשר לקצור תולעים בוגרות לתרבות ואוסף של חומרי הפרשה-הפרשה מday 14 3. ואילך H. polygyrus גם אינטראקציה עם מיקרופלורת commensal, עם לקטובצילוס המוגבר הנוכחית בעכברים נגועים רגישים 4-6, ורמות גבוהות של ח זיהום polygyrus בעקבות החשיפה של עכברים ללקטובצילוס 6.
זיהום פעיל עם ח ' polygyrus הוכח כדי להגן מפני immunopathology במודלים של בעלי חיים רבים של אוטואימוניות 7-10, קוליטיס 11,12 והאלרגיה 13-16. כתוצאה מכך חל עניין רב בפוטנציאל של מולקולות טרמינל-הפרשה מטפיל זה ("הס") ללמטה לווסת פתולוגיה in vivo 17,18. ואכן, השפעות מגנות נראות לאחר טיפול של עכברים עם מוצרי הס 19 דרך מסלולים אשר כעת עוברות זיהו 18,20. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצור אמין של polygyrus Heligmosomoides וההתאוששות של מוצרים המופרשיםשיכול להיות מנוצל נוסף עבור מגוון רחב של חקירות ביוכימיים וחיסוניות תפקודיות.
Protocol
הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה מבוצעת בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד בית אנגליה ואוניברסיטת השירותים הווטרינריים אדינבורו. 1. זיהום של עכברים על ידי Gavage חנות זחלי Heligmosomoides polygyrus L3 במים מזוקקים עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, לשטוף זחלי L3 שלוש פעמים במים מזוקקים: צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות (עם בלם), להסיר את כל אבל 500 μl של מים (כדי למנוע זחלי L3 טבליות מטרידים) וresuspend גלולה בכל פעם. לשטיפה השלישית, מוסיף מים עד לנפח מדויק (בדרך כלל 40 מיליליטר) ולשאוב 20 μl עם חתך טיפ 200 μl להרחיב צמצמה. מניחים שתי 20 דגימות μl על פני השטח של צלחת תרבות 60 מ"מ ולספור את זחלי L3 (בדרך כלל ניידת, ונראה במיטבו תחת 50X הגדלה עם מיקרוסקופ לנתח). Resuspend גלולה הסופיים במים מזוקקים לconcentration של 2,000 זחלי L3 לכל מיליליטר. לייצור מעגל חיים, להדביק (C57BL / 6xCBA) עכברים 8 שבועות בן F1 עם 400 H. זחלי polygyrus L3 ב 200 μl של מים מזוקקים על ידי gavage האוראלי (לרסן את העכברים במצב הזקוף בעורף ובעדינות להעביר את מחט gavage הבוטה דרך הפה והוושט לקיבה). להתסיס ביסודיות לפני כל זיהום (זחלים ליישב במהירות במים) ולשאוב 200 μl במזרק 1 מיליליטר; להשתמש במחט gavage ייעודית עם קצה מעוגל. לזיהום ניסיון של עכברים צעירים (6-8 שבועות), או זנים טהורים אחרים (למשל C57BL / 6 או BALBc), להדביק עכברים עם 200 זחלי L3. 2. רביה ותחזוקה של H. polygyrus הנח פחם במרכז אמבטיה פלסטיק גדול ומאפשר למים ברז קרים לדרוס אותו למינימום של 30 דקות (לא רחוץ פחם פעיל הוא רעיל לזחלי L3). מסננים את המים מהאמבטיה ולמקם את הפחם על tוו שכבות של נייר סופג, והשאירו אותו חשוף לאוויר חדר עד יבש לחלוטין. אם ביצים נדרשות, לגרד צואה הראשונה מתוך המעי הגס עם מלקחיים (ומספריים במידת צורך). אם יש צורך במספר גדול של זחלי L3, מקום עכברים על רשת תיל ולאסוף כדורי צואה על פני כמה ימים. מערבבים את הצואה עם פחם מגורען ביחס של לפחות 1: 1, כדי להשיג עקביות פשוט רטוב מספיק כדי לדבוק לסנן נייר. למרוח שכבה דקה על המרכז של כמה נייר סינון לח בצלחת פטרי ומניח את זה בתיבה לחה (להוסיף קצת נייר מגבת לחה וקערת מים) בחושך במשך 12-14 ימים. הסר זחלי L3 מיום 7 ואילך, ולאסוף אותם, לפחות בשתי הזדמנויות לפני שהנייר שהושלך. הזחלים יוצרים טבעת מסביב לקצה של נייר הסינון; הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי ולשטוף את הזחלים שנשארו מהצלחת (בעזרת פיפטה ו -5 מיליליטר של מים סטריליים לכל צלחת) לתוך צינור 50 מיליליטר. Liftאת נייר הסינון ולאסוף את הזחלים שנותרו נשארו בצלחת עם מים מזוקקים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה פתרון השפכים ב XG 300 עבור 10 דקות. שטוף את הזחלים שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס בעד 50 מיליליטר של מים מזוקקים עד נדרשת. הערה: הזחלים להישאר קיימא ומזהם במשך לפחות 6 חודשים. 3. אוסף של H. מבוגרים התולעים polygyrus הכן את מכשירי Baermann שונה מראש, כפי שמוצג באיור 1. עכברים ללקט ארבע עשרה ימים לאחר ההדבקה. לשטוף את הבטן עם אתנול 70%. חותך את העור מעל הבטן ולמשוך בחזרה כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. לעשות חתך קו האמצע כדי להיכנס לחלל הצפק. הסר את המעי כולו קטן וגדול (מתריסריון הפרוקסימלי לרקטום דיסטלי). הנח לצלחת פטרי יבשה. יישר את הבטן לכל אורכו; בלו מעי גס צואה המכיל; את המקום הזה לצלחת נפרדת להכנות ביצה מאוחר יותר. בלו 20 סנטימטרים הפרוקסימלי של מעי דק שמכיל את התולעים בוגרות -identified על ידי הקיר העבה יחסית של התריסריון, ולעתים קרובות מראה אדום בשל תולעי התוך luminal. הנח לתוך צלחת פטרי (100 מ"מ קוטר) עם 5 מיליליטר של הפתרון 'הנקס, חימם עד 37 ° C (שתי דגימות לכל צלחת). פתח את חלק מעי הפרוקסימלי מלא תולעת longitudinally עם מספריים (מספריים הסתיימו עגולים הם הטובים ביותר לכך), ולגרד את החלק הפנימי של מעי בטנה עם שתי שקופיות זכוכית כדי להסיר את התולעים. ואז להשליך את קיר הבטן הנקי. תולעי טיפ לשקיות מוסלין קטנים, מצרך סגור ובטוח עם מהדקים מסביב לקצה של משפך הזכוכית (איור 1). מלא משפך עם הפתרון 'הנקס ולהוסיף כ 4 צלחות פטרי של תולעים לכל משפך. מנגנון מקום 37 ° C חממה במשך 1-2 שעות, בעדינות להסעיר חצי דרך כדי לסלקפסולת ממעי ההכנה שעשויה לחסום את מסנן המוסלין. תשמור על עצמך, כדי למנוע דליפה של פסולת מחוץ לשקית המוסלין – זה יגרום זיהום של הכנת הס הסופית. צריכה היגרו תולעים בוגרות באיטיות דרך בד המוסלין והתיישבו בחלק התחתון של מבחנת זכוכית. לנתק בזהירות את המבחנה מצינור גומי חיבור מעל הכיור (טיפול כדי למנוע אובדן של תולעים בשלב זה). בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את התולעים לתוך צינור 50 מ"ל ולשטוף שש פעמים עם הנקס 'פתרון (לאפשר תולעים להתיישב עם כוח הכבידה, להסיר תקשורת עם stripette, להוסיף 40 מיליליטר של הנקס' הפתרון וחזור חמש פעמים). הערה: תרבות תולעת חייבת להישמר סטרילי מנקודה זו ואילך. לעבור לזרימה למינרית ולשטוף עוד שש פעמים בפתרון 'הנקס סטרילי בתוספת 100 U / ml פניצילין ושל 100 מק"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, מוכן לתרבות במבחנה. רוזןתולעים בוגרות התאוששו על ידי לקיחת שתי דגימות של 20 μl נלקח עם קיצוץ קצה צהוב להרחיב צמצמה; מצפה כ -50% מהכמות של זחלים מחוסן. 4. הגדרת תרבויות להס: הכנה בינונית, כביסה תולעים בוגרות משרים את התולעים מ3.11 בכ 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% gentamycin במשך 20 דקות, והשאיר את מנוחת הצינור בזווית כדי להבטיח תולעים מכוסים במלואן. לבצע את זה בזרימה למינרית: לשטוף שוב שש פעמים עם הפתרון "הנקס (בתוספת 5 U / ml פניצילין ו5 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). הכן H. תקשורת polygrus. שמירה על סטריליות בזרימה למינרית מכסה המנוע, 500 מיליליטר של RPMI1640, להוסיף 11.1 מיליליטר של 45% גלוקוז (ריכוז סופי 1.2% כRPMI1640 מכיל גלוקוז 0.2%), 5 מיליליטר של 100x Peniclllin סטרפטומיצין (ריכוז סופי 5 U / ml פניצילין, 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר), 5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 2 מ"מ), ו5 מיליליטר של gentamycin (ריכוז סופי 1%). אל תוסיף FCS. תולעי Aliquot לתוך צלוחיות T25 פרקו, כ. 1,000 תולעים בH. 15 מיליליטר תקשורת polygyrus לכל בקבוק, ומקום זקוף ב -37 חממת ° C (5% CO 2) במשך 3 שבועות. 5. הכנת הס לאסוף הס המכיל תקשורת ותרבות מתרבויות במרווחים של לא יותר מפעמיים בשבוע, להניח בצד את האוסף הראשון לאחר 24 שעות של התרבות (עקב רמות גבוהות של זיהום LPS וחלבוני מארח – יכול להיות מעובד בנפרד או שהושלך). שמור כל איסוף נפרד ומסומן עם מספר התאריך ויצווה בבירור. החלף עם נפח שווה של H. תקשורת polygyrus בכל פעם. צנטריפוגה הס המכיל תקשורת ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אז לסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסננים דל חלבון מחייב לצינורות 50 מיליליטר. חנות ב-20 ° C במקפיא שכותרתו עם תאריך של קציר תולעת ותאריך ג הס ברורollection. לאחר 21 ימים של אוסף הס מתרבות, להשליך תולעים. 500-1,000 מיליליטר בריכה של supernatant הס (בדרך כלל ממניות קפוא, ולא כולל את אוסף שעות 24 הראשונים) ולהתרכז על מסנן 3,000 MWCO במכשיר אולטרה תחת לחץ חנקן. הערה: היה זהיר מאוד שלא לתת ליבש מסנן. כדי להגדיר את מכשיר הסינון, ראשון לשטוף את הצד המבריק 3 קרום kDa למטה בכוס 1 ליטר עם מים מזוקקים במשך 3 x 20 דקות תוך בחישה. להרכיב את מכשיר אולטרה סינון לפי הוראות יצרן עם קרום מסנן צד מבריק למעלה. מקום בארון על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר 50 מיליליטר של מים מזוקקים דרך לפני שמתחיל להתרכז הס נקווה. להוסיף צינור אחד של הס למכשיר הסינון כנדרש (100-140 מיליליטר ביום), עד הנפח מרוכז עד 2-5 מיליליטר. על מנת להסיר מזהמים מכלי תקשורת התרבות הס המכיל, להוסיף 50 מיליליטר של PYRעוגן ללא PBS למכשיר הסינון ולאחר מכן להתרכז עד כ 2 מיליליטר. חזור על פעולה זו פעמיים (150 מיליליטר של PBS בסך הכל). העבר את הס לתוך צינור 15 מיליליטר, לעקר מסנן (עם מסנן 0.2 מיקרומטר) בזרימה למינרית ולמדוד ריכוז חלבון באמצעות ספקטרופוטומטר (E 280 = 10) או על ידי assay ברדפורד. Aliquot, תווית עם מספר האצווה ותאריך, והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. בצע assay LAL chromogenic על פי הפרוטוקולים של היצרן על כל אצווה של הס לפני השימוש. אם רמות LPS הן גדולות מ -1 U LPS חלבון 1 מיקרוגרם ל, לשקול לא באמצעות אצווה זה לin vivo ניסויים או בתרבויות חוץ גופית. לעבד את הס שנאסף ב 24 שעות בנפרד באותו אופן; הוא יכיל LPS וכמה חלבוני מארח ו, ואילו אינו מתאים לניסויים פונקציונליים, היא מהווה מקור שימושי של מולקולות בודדות שעשויים להיות מבודדת על ידי טיהור זיקת נוגדן חד שבטי. </ol>
Representative Results
רגישות לזיהום עם ה ' polygyrus נשלט במידה רבה על ידי הרקע הגנטי של זן העכבר (טבלת 1); עכברי C57BL / 6 וCBA רגישים 21,22 מאוד. לתחזוקה של מחזור החיים טפילים, ההיברידי F1 בין שני זנים אלה נבחר ליכולתו לעמוד נטל תולעת הרבה יותר גבוה ללא תחלואה (נזק אפיתל במעי מוגזם) בהשוואה לאו מתח הורי. האוראלי gavage של 400 זחלי L3 משמש כדי לשמור על מחזור החיים בעכברי F1 (וכתוצאה מכך נטל תולעת בוגר שמוצג באיור 2), בעוד במינון של 200 זחלי L3 משמש בדרך כלל לניסויים בזנים טהורים הומוזיגוטים (למשל, C57BL / 6 או BALBc). עם זאת, מינון זה ייתכן שיהיה הצורך מופחת בהתאם לשיתוף גורמים סביבתיים שעלולות להיות שונה בין מתקני בעלי חיים, כגון שינויים בפלורת מעיים. קבוצות של הס הוכיחו אפי לשעתקcacy במבחנים פונקציונליים ובהרכב חלבון; יתר על כן, כאשר supernatants מכל שבוע של התרבות רצוף נותח, עד לסך של 4 שבועות, פרופילי החלבון נמצאו דומה מאוד (איור 3). כאשר ריכוז הס נמדד על ידי assay ברדפורד (ראה 5.5), הכולל חלבון הוא בדרך כלל כ 1 / מ"ג מיליליטר (איור 4). שיטה חלופית של ריכוז הס היא עם רכז צנטריפוגלי (למשל קרום חתוך 3-kDa Vivaspin), שבו דגימות הם הסתחררו במהירות של עד 4,000 גר 'בצנטריפוגה הרוטור את נדנדה, הסרת מלחי חיץ ורכיבי משקל מולקולריים נמוכים. ריכוז צנטריפוגלי הוא מתאים ביותר לנפחים קטנים עיבוד (1-10 מיליליטר) ומוגבלים לגורם ריכוז מרבי של כ 30x. בעת איסוף הס, הימנעות מזיהום היא קריטית. כדי למנוע זיהום עם מולקולות מארח, אנחנו זורקים את הס-המשךaining תקשורת ותרבות מ24 שעות הראשונות לאחר קציר תולעת בוגר מהמעי העכבר. אנחנו גם לכמת את רמת זיהום LPS בכל אצווה של הס עם assay Chromogenic LAL (ראה 5.7). 1 U של LPS משווה ל ~ 100 pg LPS והרמות מתחת זה נחשבות זניח 23. בידיים שלנו, רוב קבוצות של הס באופן משמעותי מתחת לגבול זה, הריכוז הממוצע של LPS בהס להיות 0.23 U / מיקרוגרם (איור 5). ההשפעות של LPS במודלי in vivo של פתולוגיה (למשל דיכוי תגובות אסתמה) דורשת לפחות 10 ng של LPS 23. מכאן בממשל vivo של 5 מיקרוגרם הס מיצווה עם 100 pg LPS / מיקרוגרם הס יכלול 500 pg LPS, הרבה מתחת לריכוז היעיל בי LPS הופך לבעיה. איור 1: מכשירי Baer Baermannהתקנת מכשירי מאן לאוסף של H. הבוגר polygyrus (כפי שתואר בסעיף 2). איור 2: ממוצע נטל תולעת 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 תולעת L3 זחלי Mean מכביד 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 זחלי L3. נקודות הנתונים המוצגות הן מ -19 סיבובים נפרדים של זיהום של עכברי C57BL / 6xCBA. ממוצע ± SEM מוצג. איור 3: פרופילי חלבון של הס משבועות רצופים בפרופיל SDS-PAGE תרבות של חלבוני הס שנאספו בשבועות רצופים של התרבות. איור 4: </s> כמות סופית של הס מ -500 מדיה תשואה של חלבון הס מ -11 קבוצות שונות הנגזרות מכ -500 מיליליטר של supernatant התרבות המכיל ES מיליליטר. ממוצע ± SEM מוצג. איור 5: LPS זיהום של רמות הס של זיהום LPS ב 41 קבוצות של הס שנמדדו על ידי assay ameobocyte Limulus. ריכוז LPS חציון = 86 U למ"ג של הס. איור 6: אנימציה סכמטי של H. סיכום polygyrus מחזור החיים של שלבי מחזור החיים של מפתח מgavage הפה של זחלי L3, דרך התאוששות של תולעי זחלים ומבוגרים לבידודה של הס. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "תמיד"> איור 7: אנימציה סכמטי של הס ופונקציות ההשפעות החיסונית מפתח של מתווכים מסיסים וexosomes הכילו בתוך הס. גנוטיפ (ומתח ברקע) הפנוטיפ זיהום העיקרי התייחסות זנים טהורים / J, CBA, C3H מאוד רגיש 22,29 C57BL / 6 וC57BL / 10 רגיש 22,30 BALB / ג, DBA / 2, 129 / J ביניים 22,31 NIH, SJL, SWR </td> רגישות נמוכה 22,32 מהונדס לציטוקינים או קולטני ציטוקינים IL-1β – / – רגיש יותר 33 IL-1R – / – רגיש פחות (א); לא חל שינוי ברגישות אך גרנולומות המוגברת (ב) (א) 33 (ב) 34 IL-2Rβ הטרנסגניים (C57BL / 6) עמיד 35 IL-4 – / – פוריות גבוהה יותר 36 IL-4R – / – (C57BL / 6 או BALB / ג) מאוד רגיש 22 IL-6 – / – (BALB / c או C57BL / 6) מאוד עמיד 37 IL-9 טרנסגניים(FVB) עמיד 38 IL-21R – / – (C57BL / 6) Th2 הלקוי, ירד gormation granuloma 39,40 IL-25 – / – (BALB / ג) רגיש יותר 33 IL-33R (T1 / ST2) – / – (BALB / ג) אין שינוי ברגישות 33 TGFβRIIdn (C57BL / 6) Th1 הגבוה רגישות מוגברת, 41,42 מהונדס עבור סמני תא T CD28 – / – (BALB / ג) פוריות שולית גבוהה יותר 43 CD86 (B7-2) – / – (BALB / ג) פוריות גבוהה יותר 44 OX40L – / – (BALB / ג) ופוריות גבוהה יותר160 #; 45 מהונדס ללוקוסי חיסון מולדים קולט מסוג 1 אינטרפרון (IFNAR) – / – (C57BL / 6) פוריות גבוהה יותר, יותר גרנולומות 34 MyD88 – / – (C57BL / 6) יותר גרנולומות עמידה יותר, 34 C-KitW / WV (WBB6) רגיש יותר 46,47 טבלת 1: זיהומים ראשוניים עם ח ' polygyrus בזנים שונים עכבר וגן-targetted גנטיים.
Discussion
מחזור החיים של H. תמורת polygyrus באופן מהימן ועקבי. בעקבות בליעה טבעית או gavage פה של זחלי L3 ביום 0, ציסטות מתחילות להיווצר מתחת לserosa התריסריון ביום 5, התקדמו לmoults זחל ולאחר מכן מתעוררות כמו תולעים בוגרות לתוך לום הבטן מיום 10, ניתן לראות ביצים בצואה מ יום 14 וגרנולומות גלויים על פני השטח serosal התריסריון מיום 21. הפרוטוקול שתואר לעיל (ומסוכם באיור 6) מאפשר לייצור תפוקה גבוהה של ח מוצרי polygyrus הפרשה-הפרשה (הס), בנוסף להתאוששות אמינה של זחלי L3 קיימא לזיהומי מחזור ניסיוניים וחיים בעתיד.
זיהום polygyrus H. הוכח להיות מגן במודלים של אסתמה תלויות בOVA או Der p 1 (אלרגן קרדית אבק הבית) 14. יתר על כן, דיכוי הדלקת בדרכי אוויר יכול להיות מועבר עם CD4 + CD25 + </sup> תאי T רגולטורים 14 או CD19 + CD23 תאי B רגולציה היי 24 מאינם רגישים, ח ' polygyrus -infected עכברים. במודלים של אוטואימוניות, ח ' זיהום polygyrus הוכח להיות מדכא במודל הניסויי Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE) של טרשת נפוצה 9, ודיכוי ניתן להעביר גם עם תאי CD4 + T או CD19 + B תאים מעכברים נגועים 24.
חומרי ההפרשה-הפרשה polygyrus Heligmosomoides (הס) לווסת את התגובה החיסונית המארחת ולדכא דלקת בתיווך Th2 על ידי מספר המנגנונים (שמתוארים באיור 7), ובם: א) עיכוב של היענות תאים דנדריטים לגירוי 25, ב אינדוקציה) של CD4 תאים + Foxp3 + רגולציה T 18. וג) מצור של IL-33 ייצור 20. הס הוכח להיות מגן כאשר מנוהלרגישות t או אתגר במודל OVA-אלום של אסטמה 19 וגם כאשר מנוהל intranasally עם האלרגן תמצית Alternaria 20, דרך דיכוי של IL-33 שחרור מוקדם. הימנעות מזיהום LPS של הס היא לעתים קרובות חיונית להצלחה של ניסויים חיסוניים עתיד. בפרוטוקול שתואר כאן, השלבים הקריטיים בהשגת מטרה זו הם להבטיח כי פסולת הכלול בתוך שקיות המוסלין של מכשירי Baermann לא נכנס להכנת הס הסופית (ראו 2.10) ולהניח בצד את פתרון ES מהשעה 24 הראשונה של תרבות (ראה 5.1).
בשנים האחרונות, הס התאפיין ביסודיות ברמת proteomic עם מעל 370 חלבונים שונים זיהו 26,27. בנוסף, ES מזחלי שלב 4 כבר נתון לניתוח proteomic 28. עבודה שוטפת כוללת אפיון הרכיבים העיקריים של סוכרי הס, ידועים להיות מאוד חיסוני 3, ומופרשת מיקרו-RNשכגלומים 50-100 ננומטר שלפוחית או exosomes (Buck et al., הוגשה לפרסום). עם הקמתה של פרוטוקולים לשחזור לאיסוף ES מטפיל המערכת החיסונית הזה מאוד, ועם נתונים proteomic נרחבים זיהוי הרכיבים המולקולריים של הס, השלב מוגדר כעת לזיהוי והבדיקה רפואית של מולקולות בודדות מH. polygyrus שיכול לתווך השפעות מרכזיות על המערכת החיסונית המארח.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Amicon concentrator | Millipore | 5112 | Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122 |
| Hanks’ buffered salt solution | Sigma | H9394 | 500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en®ion=GB |
| Penicillin streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081 |
| Activated charcoal | Merck | 1.09624.0500 | 18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624 |
| Glucose solution | Sigma | G8769 | 100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en®ion=GB |
| Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | 50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon |
| T25 Flasks | Sigma | CLS430639 | 25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en®ion=GB |
| Chromogenic LAL assay | Lonza | 50-647U | QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx |
| Gentamicin | Gibco | 15710-049 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072 |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875093 | 500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093 |
References
- Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
- Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
- Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
- Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
- Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
- Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
- Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
- Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
- Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
- Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
- Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
- Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
- Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
- Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
- Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
- Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
- Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
- McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
- McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
- Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
- Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
- Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
- Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
- Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
- Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
- Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
- Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
- Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
- Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
- Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
- Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
- Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
- Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
- Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
- Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
- Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
- Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
- Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
- King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
- Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
- Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
- Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
- Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
- Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
- Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus–the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
- Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).
Cite This Article
Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).