Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

NOTA: Tutti gli esperimenti sono effettuati sulla base di protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale a SingHealth. 1. Brains raccolta precoce postnatale mouse Prima di dissezione, preparare la soluzione di digestione del tessuto dell'ippocampo: 10 microlitri papaina per soluzione salina bilanciata 1 ml 1x di Earle (EBSS) (+ 1% HEPES) con Deoxyribonuclease I (DNasi I) (250 U / ml) e dispasi II (1 U / ml). Rendere circa 2,5 ml della soluzione di digestione tessuti e filtrare utilizzando un'unità 0.20 micron filtro. Mantenere la soluzione calda a 37 ° C fino al momento dell'uso. Anestetizzare le postnatale giorno 5 (P5) cuccioli di topi mettendoli in ghiaccio per 5 min. Togliere dal ghiaccio e di prova per il dolore reflex via punta o la coda pizzico. Spruzzare i cuccioli con il 70% di etanolo. Decapitare il cuccioli e posizionare le testine in una capsula di Petri sul ghiaccio. Effettuare una incisione nella pelle lungo la linea mediana, dalla base del cranio al naso, con un paio di piccolo scissors o pinza sottile dissezione. Sbucciare aprire la pelle e fare un'incisione simile attraverso il cranio. Fare due ulteriori tagli orizzontali su ogni lato del cranio, uno rostrali (al bregma) e una caudale (al lambda). Peel aprire il cranio lungo le linee incise per esporre il cervello sottostante. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere il cranio sovrastante i bulbi olfattivi, e un osso linea mediana tra di loro. Fate questo mentre si tiene la testa stabile con un paio di pinze in mano non-dissezione. Facilità la parte piatta di una spatola tra la parte ventrale del cervello e la base del cranio all'estremità caudale. Mantenendo la spatola parallela alla base del cranio sotto il cervello, spostarla verso la fine rostrale del cranio di recidere eventuali aderenze tra il cervello e la base del cranio. Scoop il cervello con la spatola e mettetelo in una capsula di Petri contenente ghiacciata EBSS 1x (+ 1% HEPES). Mantenere i tessuti sommersi in ogni momento. Per tuttipassi micro-dissezione, lavoro sotto un microscopio da dissezione e utilizzare un paio di belle dissettore in ogni mano, uno per il taglio dei tessuti, e l'altro per la tenuta del tessuto stabile. Effettuare un taglio solo posteriormente alla corteccia cerebrale per separarlo dal rombencefalo. Tagliare lungo la linea mediana di separare la corteccia cerebrale nei suoi due emisferi. Rimuovere le meningi dagli emisferi cerebrali. Inserire un emisfero lato mediale e inserire le pinze nel ventricolo laterale sotto l'ippocampo. Tagliare il mesencefalo. Effettuare tagli alle estremità superiore e inferiore del ippocampo, e nei pressi del dentato / entorinale giunzione corteccia di isolare l'ippocampo dalla corteccia. Raccogliere il ippocampi in un piatto contenente ghiacciata EBSS 1x (+ 1% HEPES). 2. ippocampale Tissue Dissociazione Trasferire il dell'ippocampo di un piatto contenente la soluzione pre-riscaldato digestione del tessuto dell'ippocampo. Mince tsi ippocampali tessuti più fine possibile e incubare per 30 min a 37 ° C. Dissociare delicatamente i tessuti nelle singole cellule di cellule pipettaggio e meccanici di trasmissione in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 200 xg per 5 min e rimuovere il surnatante. Pellet Risospendere in 20 ml 0.5x soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenenti saccarosio (0,9 M) e centrifugare a 200 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in 2 ml di mezzo NPC manutenzione (Tabella 1), posto sulla sommità di 10 ml di 4% Bovine Serum Albumin (BSA) in soluzione 1X EBSS e centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e aggiungere topo NPC terreno di mantenimento (Tabella 1) al pellet. Pipettare delicatamente su e giù per 5-10 volte a garantire pellet è suddiviso in singole cellule. Trasferire le cellule contenenti medie in piastre Matrigel pre-rivestito e aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF) e fibroblav fattore di crescita 2 (FGF2) (entrambi 20 ng / ml) in eparina (5 mg / ml). Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. 3. Manutenzione di Aderente topo ippocampale NPC Preparare i piatti rivestiti / flaconi almeno un'ora prima del mouse passaging NPC dell'ippocampo. Aggiungere abbastanza Matrigel a coprire la superficie di ciascuna piastra o beuta ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere i supporti da 90% di topo confluenti culture NPC e lavare una volta con 1x tampone fosfato (PBS) quindi aspirare PBS off. Aggiungere sufficiente soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che tutte le cellule sono distaccato, cercando al microscopio in campo chiaro invertito a 10X di ingrandimento. Se ci sono ancora le cellule attaccate, incubare cultura nave per altri 1-2 minuti e verificare di nuovo le cellule. Aggiungere il doppio della quantità di Modified F-12 Nutrient Miscela Eagle Medium / di Ham di Dulbecco (DMEM / F-12)come quello della soluzione di distacco cellulare nei pozzetti / flaconi volta tutte le cellule hanno staccato. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in 5 ml di manutenzione del mouse NPC medio (Tabella 1). Pipettare delicatamente su e giù per rompere pellet in singole cellule. Piatto un terzo di cellule totali nella nuova cultura pozzetti / fiaschi e rabboccare sufficiente terreno di coltura integrati con EGF e FGF2. Incubare recipienti di coltura a 37 ° C e 5% CO 2. Rifornire di media ogni due giorni e dividere le celle 1: 3 ogni 3 o 4 giorni. Evitare la crescita eccessiva delle culture del mouse NPC per prevenire l'aggregazione e il distacco. 4. La differenziazione di mouse NPC in astrociti Preparare poli-L-lisina (PLL) / laminina rivestito 12 millimetri vetrini almeno un giorno di anticipo prima di iniziare la differenziazione della NPC topo in astrociti. Aggiungi COVerslips in una piastra da 24 pozzetti e coprire tutta la superficie di pozzi con sufficiente PLL (1 mg / ml in tampone borato). Incubare la piastra notte a 4 ° C. Il giorno seguente, rimuovere PLL e lavare una volta con 1x PBS. Aggiungere laminina (1 mg / ml in ghiaccio freddo DMEM / F-12), di nuovo copre l'intera superficie di ogni pozzetto, incubare per almeno 4 ore a 37 ° C. Rimuovere i supporti da culture NPC topo e lavare una volta con 1x PBS quindi aspirare PBS off. Aggiungere sufficiente soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni e incubare per 5 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che tutte le cellule sono indipendente quindi aggiungere il doppio della quantità di DMEM / F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 media di differenziazione ml astrociti (Tabella 1). Delicatamente suspensio cell pipettan su e giù per rompere pellet cellulare in cellule singole. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro. Cellule piastra a 5 x 10 4 cellule / cm 2 in 500 ml di mezzo per ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. Sostituire la metà del mezzo con mezzo fresco ogni secondo giorno. Mouse NPC rapidamente differenziarsi in astrociti entro 2 giorni e si differenziano per una settimana prima di iniziare ulteriori esperimenti. 5. Brains raccolta embrionali di ratto e corticale Tissue Dissociazione Rimuovere differenziazione astrocyte medio (Tabella 1) da colture di astrociti e sostituirlo con il mezzo neurone primario (tabella 1), almeno 4 ore prima di iniziare la raccolta di cervello dei topi embrionali. Prima di dissezione, preparare la soluzione di digestione tessuto corticale: 10 microlitri papaina per 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) con 12,1 mg / ml di L-cisteina. Fare circa 2.5 Ml di soluzione di digestione dei tessuti e filtrare utilizzando una unità di 0.20 micron filtro. Mantenere la soluzione calda a 37 ° C fino al momento dell'uso. Euthanize la diga incinta per asfissia di anidride carbonica con gas compresso. Test per il dolore riflesso via punta o la coda pizzico. Posare il lato ventrale degli animali su un tampone assorbente e bagnare la sua zona addominale con il 70% di etanolo. Pizzicare la pelle con un paio di pinze e fare una incisione laterale con un paio di forbici chirurgiche, sufficientemente ampia per esporre l'addome. Afferrare il peritoneo con le pinze e tagliare aprire la cavità addominale. Sollevare il corno uterino con le pinze e tagliare gratuitamente lungo la mesometrio. Inserire l'utero sezionato in una capsula di Petri su ghiaccio. Separare ogni embrione tagliando il tessuto uterino tra loro. Fare un'incisione nel sacco embrionale. Shell delicatamente il feto attraverso l'apertura. Decapitare il feto e posizionare la testa in una capsula di Petri sul ghiaccio. Per raccogliere embryonic cervello dei topi, seguono la descrizione da passaggi 1,3-1,5. Per analizzare i tessuti corticali, inserire un cervello emisfero laterale alto. Tagliare l'emisfero in due lateralmente dal centro. Eliminare il mezzo più vicino alla base del cervello. Tagliare il tessuto asportato per rimuovere il mesencefalo. Trasferire i tessuti corticali di un piatto contenente la soluzione pre-riscaldato digestione tessuto corticale. Macinare i tessuti corticali a più fine possibile e incubare per 30 min a 37 ° C. Trasferire i tessuti corticali dalla soluzione di digestione del tessuto in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml medie neurone primario pre-riscaldato (Tabella 1). Dissociare il tessuti corticali ripetutamente loro pipettando su e giù in una pipetta sierologica, fino ad ottenere una soluzione omogenea senza pezzi di tessuto. Far passare la soluzione di tessuto attraverso un colino cella di 70 micron per filtrare i restanti grumi di tessuto. Aliquota della soluzione del tessuto in 15 mlprovette, aggiungendo circa 3 ml in ogni provetta. Aggiungere 800 microlitri 7,5% BSA in PBS 1x al fondo di ciascun tubo, formando due strati con la soluzione di tessuto in alto e in basso BSA. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante, aspirando dall'interfaccia dei due strati. Evitare disturbare il pellet di cellule sul fondo della provetta. Risospendere ciascun pellet cellulare in 1 ml di mezzo neurone primario (Tabella 1) e combinarle in una provetta da centrifuga da 15 ml. Determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro. 6. elettroporazione e placcatura di primaria neuroni corticali NOTA: Il trasferimento genico può essere ottenuta utilizzando vari metodi, tra cui elettroporazione, fosfato di calcio trasfezione e trasduzione virale. In questo protocollo, si descrive l'elettroporazione di consegnare ChR2 costruire in neuroni corticali primarie. Centrifuga 6 x 10 6 neuroni corticali di ratto aT 200 xg per 5 min e rimuovere il surnatante. Almeno 6 x 10 6 neuroni corticali sono necessari per elettroporazione per assicurare la formazione di una rete neuronale sopravvivendo neuroni. Aggiungere 100 ml di soluzione di elettroporazione alla cella pellet e risospendere delicatamente. Combina 100 ml di sospensione cellulare con 6 mg di Plenti-Sinapsina-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plasmide e trasferire nella cuvetta certificata. Evitare di produrre bolle d'aria durante il trasferimento. Selezionare e applicare il programma appropriato per elettroporazione secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'elettroporazione, aggiungere 500 ml di MEM per sospensione cellulare / DNA alla provetta. Trasferire il campione in 11,5 ml di mezzo neurone primario (tabella 1) e risospendere delicatamente. L'importo totale dei mezzi di comunicazione è sufficiente per un intero 24-pozzetti. Aliquotare 500 ml di media per ogni pozzetto di una 24-pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO 2. </ol> 7. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte NOTA:. Questo metodo è stato adattato da Okita et al 10 Cultura fibroblasti umani in DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) in 6 pozzetti. Prima di iniziare riprogrammazione dei fibroblasti, cappotto 6 pozzetti con Matrigel e incubare per almeno un'ora a temperatura ambiente. A 80% confluenza, rimuovere i supporti da colture di fibroblasti e lavare una volta con 1x PBS. Aggiungere sufficiente 0,25% tripsina-EDTA per coprire tutta la piastra e incubare a 37 ° C per 10 min. Una volta che le cellule hanno staccato dai pozzi, aggiungere il doppio della quantità di DMEM con 10% FBS a quella di tripsina per spegnerai tripsina digestione. Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere le cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro. Trasferimento 7 x 10 5 cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 5min. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare in soluzione elettroporazione. Elettroporazione i fibroblasti secondo le istruzioni del produttore. Risospendere le cellule in 100 ml di buffer di elettroporazione e aggiungere 1 mg di ogni episomiale vettoriale. Cellule elettroporazione con impostazioni di 1.650 V, 10 ms e 3 impulsi di tempo. Sospensione cellulare Trasferimento in DMEM integrato con il 10% FBS e piastra 5 x 10 4 cellule per pozzetto di un 6-pozzetti. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 48 ore, rimuovere i supporti da colture di fibroblasti transfettate e sostituirlo con mTeSR media. Sostituire terreni di coltura tutti i giorni fino cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) colonie sono pronti per essere isolato. colonie IPSC possono essere osservati dopo 28-35 giorni. Quando si è pronti per l'isolamento, tagliati meccanicamente una colonia iPSC e reseed in mTeSR media con 10 pM Rho-associata proteina chinasi (ROCK) inibitore (Y-27632) su un rivestito 6-pozzetti Matrigel 12. Sostituire terreno di coltura al giorno. 8. neurale induzione e mantenimento di NPC umani NOTA:. Questo metodo è stato descritto da Li et al 11 Quando le culture IPSC sono circa il 20% di confluenza, rimuovere mTeSR media e sostituirlo con il mezzo di induzione neurale (Tabella 1). Rifornire di media ogni due giorni. Dopo 7 giorni, rimuovere medie induzione neurale e sostituirlo con terreno di mantenimento NPC umano (Tabella 1). Rifornire di media ogni due giorni fino a 7 giorni prima della passaging culture. Prima passaging culture, piatti cappotto / palloni con Matrigel a temperatura ambiente per almeno un ora. Rimuovere i supporti da confluenti culture NPC umani e lavare una volta con 1x PBS quindi aspirare PBS off. Aggiungere la soluzione il distacco delle cellule sufficiente a coprire tutti i pozzetti e quindi incubare per 5 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato. Aggiungere doppio della quantità di DMEM /F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute. Trasferire DMEM / F-12 celle contenenti in 15 ml provetta da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di mezzo umano NPC manutenzione (Tabella 1). Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere le cellule. Piatto un terzo di cellule totali in Matrigel rivestite cultura pozzetti / fiaschi e top up medio sufficiente supplementato con 10 micron Y-27632. Incubare recipienti di coltura a 37 ° C e 5% CO 2. Culture Split 1: 3 ogni 3 o 4 giorni e rifornire di media ogni due giorni. Mantenere culture NPC umane ad alta densità per evitare la differenziazione. 9. Differenziazione dei NPC umani in neuroni in co-culture Aggiungere il vettori lentivirali Synapsin1-tdTomato alla cultura NPC umana prima di iniziare la differenziazione in neuroni. Preparare astrocyte / neurone corticale co-cultureun giorno di anticipo prima differenziazione NPC umani. Lavare le culture NPC umani una volta con 1x PBS e aggiungere abbastanza soluzione distacco cellulare per coprire tutti i pozzetti / palloni poi incubare per 5 minuti a 37 ° C. Assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato. Aggiungere doppio della quantità di DMEM / F-12 come quella della soluzione distacco cellulare ai pozzetti / beute. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di mezzo differenziazione neuronale (Tabella 1). Delicatamente pipetta cellule sospensione su e giù per rompere pellet in singole cellule. Contare il numero di singole cellule con un emocitometro. Con attenzione aspirare media da corticali culture neuroni astrociti /. Piatto NPC umani a 5 x 10 3 cellule / cm 2 in 500 ml di terreno di differenziamento neuronale (Tabella 1) supplementato con 10 mM Y-27632 per ogni 24 pozzetti. Aggiungere delicatamente terreno contenente NPC umani in ciascun pozzettoper evitare di disturbare gli astrociti e neuroni corticali. Incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2. Sostituire la metà della media con terreno fresco ogni due o tre giorni per almeno 28 giorni. 10. elettrofisiologici registrazioni di neuroni iPSC-derivati Verificare se iPSCs umani si comportano come neuroni maturi. Trova cellule differenziate da iPSCs umani da parte di visualizzazione di tdTomato utilizzando un microscopio confocale verticale dotato di 60X (0,9 NA) dell'obiettivo immersione in acqua. Estrarre registrazione pipetta ad una resistenza di 4 a 6 cellule M. Perfuse a temperatura ambiente in una soluzione esterna (Tabella 1) gorgogliare costantemente con il 95% O 2/5% CO 2. Riempire il micropipetta registrazione con la soluzione interna (Tabella 1). Patch tdTomato + cellulare in modalità whole-cell e azione di registrazione potenziale cottura in risposta alla iniezione di corrente (1 durata sec, 10 incrementi Pa) in curAffitto morsetto. Confermare se potenziale d'azione delle cellule corticali esprimono ChR2 è affidabile evocata dalla stimolazione della luce. Trova le cellule corticali esprimono ChR2 per la visualizzazione di GFP sotto un microscopio confocale. Eseguire cellula intera registrazione patch clamp su cellule corticali seguendo i passaggi da 10.1.2 a 10.1.3. Potenziale Controllare azione è affidabile evocata da illuminazione luce con lampada a vapori di mercurio (100 W). La lunghezza d'onda del filtro di eccitazione è 480/40 nm. Eseguire stimolazione optogenetic. Patch tdTomato + cellulare in modalità tutto-cell e impostare morsetto tensione -70mV. Filtro segnali di corrente a 2 kHz e digitalizzare a 10 kHz. Monitorare resistenze serie da 10 a 20 M per consistenza durante le registrazioni. Stimolare intero campo da 100 W Filtro lampada al mercurio con 480/40 nm di eccitazione per 30 sec. Correnti postsinaptiche Record (PSC) di cellule patch indotta da fotostimolazione di ChR2 esprimono cor presinapticaneuroni tici. Rilevare e misurare PSC. Impostare la soglia per l'ampiezza e la zona correnti a 5 Pa e 20 pc, rispettivamente. Controllare manualmente questi eventi per eliminare eventuali tracce non-PSC.