تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة
Summary
يتم وصف طرق لخزعة من الوحشية المتسعة، وإعداد الميتوكوندريا النقى والتنميط respirometric. استخدام حجم العضلات الصغيرة يجعل هذه التقنية مناسبة لتطبيقات البحوث السريرية.
Abstract
يستخدم التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة عادة للتحقيق في سلسلة نقل الإلكترون وظيفة. نحن تصف طريقة للحصول على عينات من الوحشية المتسعة الإنسان، عزل الميتوكوندريا من كميات ضئيلة من الأنسجة العضلية الهيكلية، ومقرها لوحة التنميط respirometric باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل. مقارنة لمحات respirometric تم الحصول عليها باستخدام 1.0، 2.5 و 5.0 ميكروغرام من الميتوكوندريا تشير إلى أن 1.0 ميكروغرام يكفي لقياس التنفس وأن 5.0 ميكروغرام يوفر نتائج أكثر اتساقا على أساس المقارنة بين الأخطاء المعيارية. تحليل لطخة الغربي من الميتوكوندريا معزولة عن علامة الميتوكوندريا COX IV وغير الميتوكوندريا علامة الأنسجة GAPDH تشير إلى أن هناك تلوث غير محدود الميتوكوندريا باستخدام هذا البروتوكول. القدرة على دراسة قياس التنفس الميتوكوندريا في اقل من 20 ملغ من الأنسجة العضلية تتيح للمستخدمين الاستفادة من الخزعات الفردية بالنسبة لنهايات متعددة في دراسة سريريةالمشاريع البحثية.
Introduction
الميتوكوندريا هي مواقع إنتاج الطاقة الأولية في الخلية ولها أدوار مهمة في الشيخوخة فضلا عن مختلف اضطرابات سن ذات الصلة، مثل أمراض القلب والشرايين، ومرض الزهايمر، ومرض السكري، والسرطان، والسمنة. التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة يوفر التحليل المباشر لسلسلة نقل الإلكترون (ETC) وظيفة وساهم بشكل كبير في فهمنا للبيولوجيا الميتوكوندريا ودورها في الصحة والمرض. وتستخدم الميتوكوندريا المعزولة لدراسة جوانب مختلفة من الطاقة الحيوية مثل النقل الركيزة، والنشاط سينسيز اعبي التنس المحترفين، تسرب بروتون، الخ وقد تم تحسين المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة للسماح تحليل respirometric الميتوكوندريا المعزولة من عينات للفحص أنسجة العضلات والهيكل العظمي تم الحصول عليها من البشر. وقد استخدمت بروتوكول خزعة الموضحة في هذه المخطوطة من قبل العاملين لدينا على مدى السنوات ال 12 الماضية. كان أداء مجموعتنا أكثر من 700 إجراءات على الكبار من مختلف الأعمار،تصل إلى 90 عاما، ومع مختلف الحالات المرضية المزمنة دون أي قضايا السلامة السلبية. أحد الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه مصمم خصيصا للاستفادة من كميات ضئيلة من الأنسجة، مما يسهل استخدامها في البحوث والدراسات السريرية.
وقد وضعت بروتوكولات مختلفة لعزل الميتوكوندريا. فرنانديز-Vizarra وآخرون 1،2 وصف طريقة لعزل الميتوكوندريا من أنسجة الفئران المختلفة وكذلك الخلايا المستزرعة. وأفادت جارسيا لCazarin وآخرون. 3 وسيلة لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي من الجرذان والفئران. كما تم الإبلاغ عن طريقة لعزل الميتوكوندريا من دماغ الفئران التي ايغليسياس-غونزاليس وآخرون 4 الإجمالي.، وآخرون. 5 وذكرت وسيلة لعزل الميتوكوندريا باستخدام barocycler و / أو التقطيع معاهدة التعاون بشأن البراءات. مؤخرا، ذكرت فرانكو وآخرون. 6 وسيلة لعزل الميتوكوندريا التخصيب باستخدام المضادة-TOM22 حبات مغناطيسية.
في حين أن هذه البروتوكولات تسفر عن نتائج ممتازة، ومتطلبات حجم الأنسجة مرتفعة مقارنة مع الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة. على سبيل المثال، جروس وآخرون. 5 تستخدم 1.5-1.8 غرام من عضلة الساق، وحوالي 2 غرام من أنسجة الكلى. وبالمثل، وتستخدم فرانكو وآخرون 6 500 ملغ الأنسجة الكبد الماوس. من تجربتنا، والمحاصيل التقليدية التي يمكن توقعها من إبرة الخزعة عن طريق الجلد من العضلات الهيكلية (الوحشية المتسعة) تتراوح ما بين 100-200 مجم. القدرة على تقييم وظيفة الميتوكوندريا في 20-50 ملغ من الأنسجة العضلية باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا تسمح للمستخدمين إجراء عمليات تقييم متعددة لكل خزعة وعينات متجر لاستخدامها في المستقبل في غيرها من التجارب البيولوجيا الجزيئية. هذه هي ميزة حاسمة في البحوث السريرية وغيرها من الدراسات التي تتطلب استخدام الدؤوب من العينات. وتجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا مجمدة في السابق ليست جيدة لدراسة التنفس إلى جانب بسبب outeص الضرر غشاء الميتوكوندريا وفقدان النشاط السيتوكروم C. وقد تم تكييف أسلوبنا وتعديلها من الأسلوب الذي نشرته تشابيل وبيري 7.
باستخدام الطرق الموضحة في هذه المخطوطة، ونحن قد ذكرت مؤخرا أن ملف التعريف respirometric الميتوكوندريا المعزولة من المتسعة الوحشية الإنسان مرتبطة بشكل مباشر مع القدرة البدنية، ويقاس سرعة المشية 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
وغالبا ما تستخدم الميتوكوندريا المعزولة في الدراسات أن دراسة دور وظيفة ETC، فضلا عن الأنشطة الميتوكوندريا أخرى، بما في ذلك النقل الركيزة وTCA وظيفة دورة. المقايسات Respirometric باستخدام العضيات معزولة تسمح الفحص المباشر للعمليات الأساسية للالفسفرة والخصائص الذاتية للالخ. التنميط Respirometric الميتوكوندريا معزولة بالمقارنة مع الخلايا الكاملة أو الألياف العضلية permeabilized والمزايا من السهل نسبيا تفسير البيانات وعدم وجود "تدخل" من العمليات غير الميتوكوندريا أو التغيرات في الميتوكوندريا كتلة / نشوء حيوي. ويستند تطبيع البيانات عن محتوى البروتين الميتوكوندريا، مما يسمح مباشرة عبر المقارنة من الميتوكوندريا بين العينات. التنميط Respirometric الميتوكوندريا المعزول هو النهج المفضل عندما يكون الهدف من هذه الدراسة هو تحديد الآليات الكامنة وتحديد أهداف محددة مثل عنصر ETCق / المجمعات، أو آليات النقل الميتوكوندريا.
ووصف هو بروتوكول لخزعة العضلات وعزل الميتوكوندريا وظيفية من عينات الأنسجة الصغيرة. هذه الطريقة تعطي نتائج استنساخه بين المستخدمين، نظرا للاستخدام من الخالط الآلي مقابل يد تعمل المجانسة dounce. عزل الميتوكوندريا لا يمكن أن يؤديها مع اقل من 20 ملغ من الأنسجة العضلية. كمية من الميتوكوندريا المعزولة التي يمكن الحصول عليها من هذا حجم العينة كافية لتشغيل فرس البحر قياس التنفس القائم على لوحة في حين ترك الميتوكوندريا الفائضة للتجارب والتخزين الأخرى لإجراء المزيد من التحليلات الجزيئية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الأسلوب يمكن أن تترجم إلى XF 96، حيث يمكن استخدام كميات أصغر من الميتوكوندريا (1-2 ميكروغرام لكل بئر).
عدة بروتوكولات لعزل الميتوكوندريا تعتمد على المجانسة dounce لتعطيل الأنسجة الأولي. من عيوب هذا الأسلوب هو التدريب العملي على طبيعة الأنسجة الأوليةالتجانس. قوة وسرعة مدقة في الخالط يمكن أن تختلف بشكل كبير بين المشغلين 6. هذا يمكن أن يؤدي إلى التجربة إلى تجربة الاختلاف، فضلا عن الاختلاف المختبر إلى المختبر، ويؤدي إلى صعوبة في مقارنة البيانات بين التجارب. هذا هو مصدر قلق خاص في الدراسات تدخل الإنسان عندما يتم جمع البيانات من المشاركين في نقاط زمنية منفصلة، وعادة قبل وبعد العلاج، ويحتمل أن تكون في مواقع متعددة. نستخدم الخالط الآلي لاتباع نهج أكثر اتساقا أن يعطي نتائج أكثر استنساخه مع اختلاف محدود من شخص إلى شخص. سرعة إعداد أيضا يجعل هذا النهج مناسبة للتعامل مع عينات متعددة في نفس الوقت. عادة، ما يصل الى ثلاث تجارب لا يمكن أن يؤديها في يوم واحد.
تنشأ القيود المحتملة للتقنية وصفها هنا من استخدام العضيات معزولة واستخدام شكل قائم على طبق من ذهب. على سبيل المثال، بيكار وآخرون. يكون شيطانstrated أن الميتوكوندريا المعزولة تمتلك الخصائص الفنية التي تختلف جوهريا عن تلك التي الميتوكوندريا سليمة في myofibers permeabilized. واقترحوا أن تقنيات عزل الميتوكوندريا تنتج في وظيفة الطاقة البيولوجية المتغيرة، مثل زيادة كبيرة RCR مقارنة myofibers permeabilized يرافقه إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية أكبر 13. مقارنة ألياف العضلات permeabilized، والعزلة الميتوكوندريا لا تتطلب وقتا أطول التحضير. أيضا، وفقدان المحتوى الخلوي يقلل أهمية الفسيولوجية، وهو الأمر الذي يتم الاحتفاظ في الخلايا الكاملة والألياف حتى permeabilized. استخدام قياس التنفس القائم على لوحة مع تصاريح تقنية الموضحة تكرار أشواط لكل عينة. ومع ذلك، يجب الميتوكوندريا تلتزم الجزء السفلي من كل بئر. هذا التكوين يختلف عن بيئتهم الطبيعية ويمكن أن يؤثر على الخصائص الوظيفية. وبالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام هذا البروتوكول لعزل الميتوكوندريا، ذره قد تكون لا تزال تلوث من الشبكة الإندوبلازمية (ER) في إعداد الميتوكوندريا. الاختلافات في تلوث ER قد تؤثر على تحديد العائد والنفوذ النتائج الميتوكوندريا.
في الختام، تقدم هذه الدراسة البيانات التي تؤكد أن الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة باستخدام هذا الإجراء تنشط وظيفيا، ويمكن استخدامها للدراسات / التطبيقات التي تتطلب عالية الجودة الميتوكوندريا معزولة عن الحد الأدنى من عينات العضلات والهيكل العظمي. وميزة هذه الطريقة هي أن: ط) أنه من الممكن عزل الميتوكوندريا من كميات ضئيلة من العضلات والهيكل العظمي، والثاني) إجراء سريع، الثالث) مع التكنولوجيا لوحة مقرها، فمن الممكن لتشغيل عينات متعددة في نفس الوقت، والرابع) هناك ما يكفي من الأنسجة الفائض والميتوكوندريا معزولة بعد الفحص الطاقة البيولوجية للتخزين العينة وغيرها من التحقيقات البيولوجية الجزيئية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Materials
| Equipment | ||
| Name of the Equipment | Company | |
| Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
| Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
| 6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
| 60cc syringe | Fisher Scientific | |
| 96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
| Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
| Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
| Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
| Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
| Consumables | ||
| Name | Company | Catalog Number |
| XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
| 100867-100 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
| ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
| Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
| Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
| EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
| BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
| Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
| Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
| Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
| ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
| XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
| Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
| Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
| MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
| Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
| Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
| Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
| Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
| *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only | ||
References
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
- Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
- Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).
- Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).
