Un approccio metodologico alle valutazioni non invasive di funzione vascolare e morfologia
Summary
The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.
Abstract
The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.
Introduction
L'endotelio è il rivestimento più interno del sistema vascolare ed è coinvolta nel mantenimento dell'omeostasi vascolare tramite la regolazione di una moltitudine di processi vasoattivi. Turbativa di questi processi può predisporre alla nave di aterosclerosi e aumentare il rischio di malattia cardiovascolare (CVD) 1. Funzione endoteliale periferica è un buon indicatore dei primi anomalie nella parete vascolare 2. Inoltre, è stato dimostrato misure della funzione endoteliale periferica per riflettere la funzione endoteliale coronarica 3-5, e come tali sono considerati buoni predittori di malattia cardiovascolare 6-9. Questo è forse non sorprende dato che l'aterosclerosi è ormai ampiamente apprezzato per essere un disturbo sistemico 10. Le valutazioni di funzione endoteliale periferico tipicamente quantificare la risposta vasodilatatrice della nave ad uno stimolo specifico, con una attenuazione della risposta dilatoria indicativo di endotelialedisfunzioni 11, e può essere misurata in diversi letti vascolari. Le valutazioni di cambiamenti strutturali avanzate nave possono essere caratterizzati da ecografia dello spessore intima-media.
Nel microcircolazione, laser Doppler flussimetria (LDF) e Laser Doppler (LDI) con ionoforesi di agonisti vasodilatatori possono fornire informazioni utili sulla microvascolare perfusione 12. Entrambe le tecniche misurano lo spostamento Doppler creato da luce diffusa dal muoversi globuli rossi. Perfusione è rappresentato come flusso sanguigno piuttosto che il flusso di sangue (ml / min), con flusso di sangue riflettente velocità eritrociti media e concentrazione. Misurazione del flusso di sangue è linearmente associato con il flusso di sangue reale 13. La valutazione di LDI offre notevoli vantaggi rispetto LDF, poiché a differenza LDF, LDI può scansione su una vasta area così contabili per l'eterogeneità del flusso sanguigno pelle e aumentando la riproducibilità della tecnica12.
Lo stimolo per aumentare il flusso di sangue durante LDI sono forniti dalla ionoforesi di agonisti vasodilatatori acetilcolina (ACh) e nitroprussiato di sodio (SNP), che valutano la funzione endotelio-dipendente e endotelio-indipendente, rispettivamente, nella pelle con una debole corrente elettrica 14. Una volta attraverso la pelle, ACh lega ai recettori muscarinici cellule endoteliali rilasciando ossido vasodilatatore nitrico (NO). L'uso di SNP attiva direttamente i recettori delle cellule muscolari lisce per consentire la massima vasodilatazione della nave e l'esame dell'integrità muscolatura liscia 15. Vi è una certa incertezza sul fatto dilatazione ACh-mediata coinvolge NO a tutti, come ACh può stimolare non NO vie come la ciclossigenasi-mediata percorsi 12. Tuttavia, abbiamo precedentemente riportato che ACh e SNP risposte sono compromesse in popolazioni di pazienti a maggior rischio di CVD 16 e che gli interventi di esercizio conosciuto per migliorare NO bioactivity anche migliorare il flusso di sangue ACh-mediata con LDI 17. Il veicolo per il trasporto degli agenti nei microvasi pelle spesso includono cloruro di sodio o di 18,19 acqua deionizzata. Funzione endoteliale microvascolare può essere quantificato utilizzando diversi approcci, con cutanea conduttanza vascolare – un prodotto di flusso e la pressione arteriosa, utilizzati negli studi in cui la pressione arteriosa può variare nel corso della durata dello studio (ad esempio, durante l'esercizio fisico o il trattamento anti-ipertensivo) 12. Un'altra quantificazione comunemente usato è quello di calcolare l'area sotto la curva di flusso di sangue o esprimere l'aumento percentuale di flusso rispetto al basale. È importante notare che non esistono linee guida stabilite per la presentazione dei dati, ma gli investigatori dovrebbe utilizzare un approccio che mostra una buona riproducibilità.
Nelle grandi vasi, dilatazione flusso-mediata (FMD) e gliceril-trinitrato dilatazione mediata (GTN) vengono eseguiti per valutares endotelio-dipendente e la funzione endotelio-indipendente rispettivamente 20. FMD è tipicamente effettuata nell'arteria brachiale cui un bracciale viene utilizzato per occludere flusso di sangue arterioso per 5 min; rilascio della cuffia provoca un repentino aumento del flusso sanguigno (iperemia reattiva) attraverso l'arteria brachiale conseguente shear stress dilatazione mediata della nave. La linea di base e il diametro rilascio post-bracciale sono quantificati con l'ecografia immagini della nave con successive valutazioni del diametro del vaso eseguita manualmente 20 o utilizzando il software di rilevamento dei bordi automatico 21,22. L'uso di GTN aiuta a determinare se le anomalie in vasodilatazione sono dovute ad una perdita di integrità delle cellule muscolari lisce, o il rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali 23. FMD e GTN sono espressi come percentuale di aumento in post-stimolo diametro del vaso rispetto al diametro di base.
La corretta valutazione di afta epizootica richiede un certo numero diConsiderazioni importanti 24,25 protocollo di studio. La durata di occlusione bracciale deve essere a tempo con attenzione; 5 min di occlusione bracciale è sufficiente per la dilatazione NO-mediata, mentre più gemelli risultati occlusione a non-NO mediata dilatazione 26. Analogamente, il posizionamento del bracciale occlusione intorno al polso e distale della sonda ecografica invoca prevalentemente NO-mediata dilatazione, considerando posizionamento bracciale sul braccio superiore e prossimale della sonda stimola NO 27 solo parzialmente. E 'anche importante misurare la dilatazione picco successivo sgonfiamento della cuffia per un periodo prolungato di tempo, come la misurazione del diametro di picco entro i primi 60 sec seguente sgonfiamento del bracciale può sottovalutare afta epizootica 25 – 40% 28. Infatti, un periodo di 180 secondi è probabile che sia sufficiente a catturare diametro reale picco, con la maggior parte dei valori di picco che si verifica entro il primo 120 sec 28.
Lo stimolo per l'afta epizootica coinvolgeres la produzione di sforzo di taglio, che attiva i recettori endoteliali specifici per rilasciare NO 29. Tuttavia, shear stress può anche attivare diversi altri fattori vasoattivi (alcuni dei quali possono causare vasocostrizione) 30, il che rende indispensabile che lo stimolo shear stress evocato riflette vasodilatazione da NO Percorsi di 26. E 'anche importante per spiegare lo stimolo sforzo di taglio durante FMD, con calcolo del gradiente di velocità (velocità / diametro) serve come misura adeguata di sollecitazione di taglio, ma non necessariamente riflettere picco di flusso 31. Recenti raccomandazioni fisiologici suggeriscono che il profilo sforzo di taglio deve essere sempre caratterizzato quando i sistemi a ultrasuoni consentono la misurazione simultanea di velocità dell'onda di polso e attiva di imaging B-mode in modalità duplex 25.
La valutazione delle arterie carotidi con B-mode ad ultrasuoni in grado di fornire informazioni sulla carotide spessore intima-media (cIMT), ed è stato il primo described in 1986 da Pignoli e colleghi 32. Valutazione della cIMT riflette la proliferazione delle cellule muscolari lisce in intima della nave ed è un predittore utile di eventi clinici ai primi di aterosclerosi 33. Carotid ecografia può spesso prevedere struttura arteriosa meglio di tecniche simili (come la risonanza magnetica o valutazioni radiografiche) 34. Inoltre, associa CIMT con un numero di classici fattori di rischio cardiovascolare tra cui l'invecchiamento, ipertensione, dislipidemia e 35. Modifiche alle pareti della carotide sono solitamente avviati da una riduzione NO biodisponibilità che promuove l'infiammazione nel recipiente 36. Le arteria carotide comune, arteria carotide interna e punti di biforcazione carotidea possono essere utilizzati per determinare cIMT, come ogni sito può parimenti prevedere eventi cardiovascolari 37.
Nel presente manoscritto, forniamo metodologia dettagliata sulla valutazione di microvasculaFunzione r endoteliale (LDI con ionoforesi), grande la funzione dei vasi endoteliale (FMD e GTN) e morfologia vascolare (cIMT). L'aterosclerosi è un processo a più stadi che inizia con la disfunzione endoteliale e termina con lesioni aterosclerotiche focali nelle grandi arterie. La motivazione per la scelta delle valutazioni di cui sopra è che riflettono le diverse fasi di aterosclerosi e contribuiscono a spiegare la natura eterogenea del sistema vascolare 38. Inoltre, abbiamo già dimostrato che in una popolazione di pazienti ad aumentato rischio di malattia cardiovascolare, la funzione endoteliale microvascolare era indipendente dalla funzione endoteliale grande vascello 39, e le valutazioni funzionali erano indipendenti dalle valutazioni strutturali del sistema vascolare 40. Pertanto, la valutazione globale del sistema vascolare può aiutare a decifrare le diverse fasi di aterosclerosi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dettagli La presente manoscritto metodologia di diverse valutazioni distinte di funzione vascolare e morfologia che possono essere eseguite nel sistema vascolare periferico. Ogni valutazione fornisce informazioni sulle distinte fasi di aterosclerosi, e contribuiscono a caratterizzare il profilo vascolare di diversi territori vascolari.
Abbiamo già riferito che la funzione endoteliale microvascolare è indipendente dalla grande funzionalità dei vasi endoteliale in una popolazione di pazienti con artrite reumatoide ad aumentato rischio di CVD 39. Inoltre, le valutazioni di funzione vascolare e morfologia erano indipendenti l'uno dall'altro nello stesso gruppo di pazienti e nei pazienti con CVD 40,41. Questi risultati possono essere spiegati con l'eterogeneità della funzione e della struttura delle cellule endoteliali vascolari in diversi territori 38, nonché un possibile intervallo di tempo per la progressione di alterazioni funzionali morfologicaanomalie nel vaso. Uno studio di Hashimoto e colleghi 42 ha rivelato che diversi partecipanti con aterosclerosi erano diminuite valori FMD ma normali valori CIMT. Questi risultati suggeriscono che l'esame di aterosclerosi subclinica utilizzando una varietà di metodi è importante per decifrare gli effetti globali della CVD.
L'importanza del microcircolo in salute e malattia sta guadagnando una crescente attenzione nella letteratura medica. I microvasi formano una superficie molto più grande di navi di grandi dimensioni che li rende obiettivi significativi per i danni da stimoli nocivi 43. E 'stato ipotizzato che microvasi potrebbero essere la fonte primaria di mediatori infiammatori che si infiltrano l'endotelio dei vasi più grandi che portano alla formazione della lesione 43. Nei diabetici di tipo II, malattie microvascolare spesso precede grande malattia del vaso 44, e in altre popolazioni con aumentato rischio di CVD, come Arthri reumatoidetis, interventi che riducono il rischio cardiovascolare migliorano microvascolare, ma non grande vascello, la funzione endoteliale 45,46. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che l'esame della funzione microvascolare può aiutare a comprendere i complessi meccanismi che iniziano l'aterosclerosi.
Nel presente lavoro, la valutazione della funzione endoteliale microvascolare è stata effettuata utilizzando LDI con ionoforesi di agenti vasoattivi. Diverse altre valutazioni possono essere utilizzati per valutare la funzione microvascolare compresi capillaroscopia ungueale e venosa occlusione pletismografia. Tuttavia, la prima valutazione fornisce informazioni sulla morfologia solo microvascolare, mentre il secondo è che richiede tempo e in alcuni protocolli invasivi dovuti alla somministrazione di agenti vasoattivi intra-brachiale 1. Al contrario, LDI offre un approccio semplice, tempo efficiente per misurare la perfusione microvascolare dei vasi sanguigni della pelle in risposta ad agenti vasoattivi quali sono somministrati non invasvamente. La misurazione del flusso sanguigno cutaneo ha guadagnato l'accettazione diffusa nella letteratura grazie alla sua facilità di accesso e di forte correlazione con definiti, CVD 12. Inoltre, il vantaggio di LDI rispetto ad altre tecniche Doppler come flussimetria laser Doppler, è che può acquisire simultaneamente più punti in una data area e può rappresentare per gli artefatti di movimento cellulari e differenze spaziali del flusso sanguigno cutaneo, entrambi i quali possono influenzare la perfusione del vaso 47,48.
Nonostante gli evidenti vantaggi di ionoforesi, è importante notare che la corrente vasodilatazione indotta (CIV) da ionoforesi può confondere gli effetti degli agenti vasoattivi soprattutto al catodo. La scelta del veicolo per la somministrazione di farmaci potrebbe contribuire a ridurre questo effetto, con 0,5% di cloruro di sodio (come utilizzato nel protocollo corrente) efficace nel limitare CIV 18. Inoltre, l'uso di grandi camere di diametro e basso elettrico curaffitti (fini del protocollo attuale) tutti contribuiscono a ridurre CIV 18. L'utilizzo di un sito di controllo è stato anche consigliato 12. Fattori biologici e comportamentali può colpire anche l'affidabilità e la ripetibilità della tecnica. Ad esempio, la variazione circadiana e il fumo hanno dimostrato di influenzare la funzione endoteliale microvascolare 49,50. Condizioni di registrazione rigorose devono essere rispettati per ottenere risultati accurati e linee guida stabilite devono essere seguite durante la progettazione di protocolli 12.
Misura di afta epizootica e la dilatazione GTN-mediata fornisce informazioni sulla disfunzione endoteliale nei grandi vasi sanguigni, ed è ampiamente utilizzato nella ricerca vascolare non invasiva. La tecnica di FMD fornisce informazioni surrogata su NO biodisponibilità ed è un marcatore prognostico utile di eventi cardiaci in diverse popolazioni cliniche 7-9. Nel presente lavoro, il protocollo presentato conti per molti dei fattori chesono necessari per un'adeguata stimolazione della NO-mediata vasodilatazione 25. Ad esempio, il bracciale occlusione stato posto distale della sonda ecografica e intorno al polso 27, la durata di ischemia era 5 min e 26 tempo adeguato è stato permesso di registrare il diametro 'vero' picco seguente iperemia reattiva 28. Purtroppo, il protocollo non ha incluso la caratterizzazione del profilo di sforzo di taglio come il software automatico di rilevamento dei bordi non ha permesso la registrazione simultanea di diametro del vaso e il segnale di velocità dell'onda di polso. Il calcolo di sforzo di taglio è parte integrante di una misurazione precisa di afta epizootica 26 e abbiamo raccomandato che, ove possibile gruppi di ricerca, vascolari utilizzano il software che permette di tali misurazioni da effettuare.
Valutazioni di FMD e dilatazione GTN-mediata sono anche suscettibili di variazioni ambientali e biologiche 24, come piccoli cambiamenti di diametro vascolare puòsuscitare grandi risposte FMD / GTN. Per esempio, per valori tipici FMD partecipanti sani vanno dal 5-10% 51, che corrisponde a 0,25 – variazione 0.5mm diametro arteriosa per un'arteria con un diametro di 5 mm. Dato queste piccole modifiche al diametro delle arterie, attenzione deve essere prestata ai fattori tecnici e biologici che possono influenzare la misura. In effetti, l'afta epizootica può essere influenzata da una serie di fattori biologici e comportamentali, come l'attivazione simpatica 52, privazione del sonno 53, il consumo di caffeina 54, fumare 55, terapia antiossidante 56 e ora del giorno 57. Pertanto, è importante controllare questi fattori utilizzando informazioni provenienti orientamenti stabiliti 24,25.
La valutazione di tecnologie avanzate, ma subcliniche aterosclerosi è stato fatto usando cIMT. La tecnica è stata utilizzata in diverse popolazioni cliniche e fornisce grande dettaglio su arteriosa structure rispetto a tecniche più sofisticate come la risonanza magnetica 34. Come con le altre tecniche vascolari, la misurazione di cIMT richiede un'attenta valutazione dei fattori tecnici che possono influenzare la misura. Generalmente, cIMT dovrebbe essere eseguita in aree libere dalla placca, nella parete di fondo della carotide comune. Simile a FMD, misurazione della cIMT viene eseguita utilizzando ad alta risoluzione ecografia e così è altamente user-dipendente. Segnalato coefficiente di variazione (CofV) gamma 2,4-18,3% 58, mentre per l'afta epizootica è 1-84% 59. Tuttavia, anche se entrambe le tecniche sono eseguite da ecografisti competenti con fattori esterni ben controllata, rimane un elevato CofV 58,60,61. Una ragione di questo potrebbe essere che l'analisi dei confini vascolari sono eseguite con metodi manuali 60,61. Tale analisi può ridurre affidabilità artefatti di imaging come falsi confini, rumore dalla ULTRASUONISegnale und, e la distorsione dei vasi possono influenzare interpretazione dell'immagine 22.
I recenti sviluppi in continua software automatizzato bordo di rilevamento hanno notevolmente migliorato il rilevamento dei confini delle pareti vascolari 21,22. Nel presente studio, VIA software è stato utilizzato per misurare il diametro dell'arteria brachiale, mentre AMS è stato utilizzato per rilevare cIMT. L'uso di questi software riduce notevolmente la dipendenza dell'operatore, ma nel caso di AMS, un certo grado di comando è ancora disponibile in situazioni in cui la qualità dell'immagine può essere scarsa 62. I laboratori che usano software automatizzato di rilevamento dei bordi in genere tendono ad avere bassi CofV 58,63,64, quindi dovrebbe essere l'obiettivo di tutti i laboratori di ricerca vascolari per incorporare la misurazione automatizzata dei confini vascolari, al fine di garantire l'accuratezza dei risultati. E 'inoltre buona norma riportare i risultati di studi di riproducibilità per protocolli specifici durante la pubblicazione dei risultati dello studio.
<p class = "jove_content"> Anche se le valutazioni di funzione vascolare sono abitualmente utilizzati nella ricerca clinica, una limitazione delle tecniche è che non esistono valori normativi per LDI con ionoforesi e l'afta epizootica. E 'quindi importante che per età e gruppi di controllo sani sesso-abbinati sono esaminati per confrontare i risultati con il gruppo sperimentale. Anche se queste tecniche associano con prognosi sfavorevole in una varietà di popolazioni con evidenza di malattia cardiovascolare 6-9, c'è ancora una carenza di studi che hanno esaminato la relazione tra funzione endoteliale poveri ed esiti avversi cardiovascolari come infarto del miocardio e ictus. Ulteriori studi prospettici sono necessari per rispondere a queste preoccupazioni. Un'altra limitazione è l'uso di operatori umani effettuare valutazioni ed effettuare l'analisi. Questo introduce una potenziale fonte di pregiudizi; Tuttavia, questo può essere limitata accecando all'operatore di garantire i risultati oppure che il lettore è diverso dall'operatore. Essoè anche importante assicurare che il lettore segue un protocollo standardizzato per l'analisi dei dati, in modo che tutti i dati sono analizzati costantemente.In sintesi, la presente manoscritto fornisce informazioni dettagliate sui passaggi metodologici necessari per eseguire correttamente le valutazioni di microvasi e funzione endoteliale grande vaso così come la morfologia vascolare della circolazione periferica. Se utilizzati insieme, le valutazioni forniscono informazioni globali sulle diverse fasi di aterosclerosi. Ulteriori studi prospettici che esaminano il ruolo potenziale diagnostico di queste tecniche sono garantiti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr George Balanos for his assistance in the flow-mediated dilatation technique.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Laser Doppler Imager | Moor Instruments, Devon, UK | moorLDI2 | |
| Iontophoresis Controller | Moor Instruments, Devon, UK | MIC2 | |
| Miochol-E 20mg | Novartis UK | Prescribed by physician | Acetylcholine for endothelium-dependent function |
| Nitroprussiat Fides 50mg | Rottapharm Spain | Prescribed by physician | Sodium nitroprusside for endothelium-independent function |
| Doppler Ultrasound | Siemens PLC, Camberley UK | Accuson Antares | |
| Glyceryl Trinitrate 500 mcg | Alpharma, Barnstaple, UK | Prescribed by physician |
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