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생물학

À faire et à ne pas faire de cryo-microscopie électronique: Notions sur la préparation de l'échantillon et de collecte de données de haute qualité pour la reconstruction 3D macromoléculaire

Published: January 09, 2015
doi:
10.3791/52311
,
1Department of Physiology and Biophysics,Virginia Commonwealth University

Summary

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Abstract

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.

The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.

The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Introduction

Le but de cryoEM est d'obtenir électrons images microscopiques de macromolécules dans leur état hydraté natif. En vertu de la macromolécule intégration dans l'eau vitrifiés, un échantillon congelé hydraté peut être directement introduit et visualisé dans l'instrument TEM. Vitrification, atteint par le flash de congélation (10 000 o C / sec), gèle l'échantillon sans cristallisation de l'eau et se assure que des réarrangements moléculaires lors de la congélation sont insignifiants. L'excès de diffusion des électrons de l'échantillon par rapport au tampon entourant fournit un contraste faible mais suffisante pour voir la macromolécule en l'absence de toute souillure 1. Traitement de l'image par ordinateur peut ensuite être utilisé pour recréer la structure 3D de la macromolécule. Grandes macromolécules dans la gamme ~ 500 kDa- plusieurs MDa sont idéales pour cryoEM échantillons (représentant plus de 80% de la microscopie électronique à la banque de données (EMDB) entrées); ceux-ci comprennent des protéines, des complexes de protéines, acide nucléique-protéine complexes, et des protéines membranaires intégrées dans une bicouche. Ces macromolécules sont moins susceptibles d'être cristallisé (avec moins de 2% des entrées dans la base de données PDB) mais il est souvent le cas que les petits morceaux résolus par cristallographie aux rayons X ou RMN peuvent être ancrées dans l'enveloppe 3D créé par cryoEM. D'autre part, certaines des plus grandes structures résolus par cryoEM sont identifiables dans la cellule complète par section mince TEM 2. Ainsi, cryoEM comble efficacement l'écart de taille et la résolution entre les structures sous-cellulaires et atomiques.

CryoEM reflète mieux la structure native de la macromolécule que la méthode plus classique de coloration négative (NS), où la macromolécule est déshydraté et entouré par une couche de lourde tache de métal dans lequel la région de l'exclusion des taches crée une image fortement contrastée "négatif" 3. Dans les deux cas, le faisceau d'électrons produit des images de projection 2D des macromolécules appelées particules, où les shape dépend de l'orientation de la macromolécule par rapport au faisceau d'électrons. Beaucoup de particules, au moins ~ 1000 et sans limite supérieure, peuvent être analysées sur l'ordinateur avec «analyse unique de particules" (SPA) logiciel pour augmenter le rapport signal sur bruit (SNR) que la moyenne, et de trouver des paramètres d'orientation spatiale de la particule nécessaire pour recréer la structure 3D de la macromolécule par rétroprojection 7.4. NS, avec SNR plus élevé, est utilisée pour la caractérisation préliminaire de l'échantillon et pour générer une reconstruction 3D de novo; sa résolution dépasse rarement 20 Å, qui est imposée par la déshydratation et la taille du grain de métal lourd. En général, pour la détermination structurelle cryoEM 3D, une reconstruction 3D basse résolution est la première obtenue de NS puis cryoEM est utilisé pour affiner carte initiale basse résolution d'étudier plus avant la macromolécule dans son état hydraté natif, pour voir sa structure interne, et d'accroître sa résolution. Aucunte que si le modèle NS a été déformée (l'exemple le plus courant est aplatissement résultant de la déshydratation 8) et les particules cryoEM eu SNR faible, alors la distorsion pourrait effectuer dans le modèle cryoEM (l'artefact modèle de polarisation, qui est commun en basse SNR ensembles de données 9). Distorsion structurelle entraînerait décalage entre les premières et les particules NS cryoEM et entre les particules de cryoEM premières et des saillies correspondantes du modèle 3D orthogonal à la direction de l'aplatissement. biais du modèle peut décider par lui-même que le modèle 3D subit des cycles de raffinement successifs. Si cela ne se produira pas, qui serait détecté que le manque de correspondance entre les particules de cryoEM premières et projections correspondantes du modèle 3D, puis un modèle de novo devrait être construit à partir des données cryoEM. Une bonne approche pourrait être d'utiliser l'algorithme de reconstitution angulaire 10, ce qui peut donner plusieurs volumes 3D possibles, et ensuite utiliser le modèle NS 3D pour sélectionner le meilleur modèle possible cryoEMqui sera affiné 11. Une meilleure stratégie consiste à augmenter le SNR du jeu de données cryoEM (voir section dédiée dans la discussion).

La qualité biochimique de la macromolécule purifiée a une plus grande influence dans le résultat final. La macromolécule, purifiée à partir de tissu ou exprimées dans des systèmes hétérologues, doit avoir un degré de pureté élevé et d'être structurellement intact. Il ne doit ni former des agrégats ne devrait pas désagréger. Pour définir une conformation particulière, les conditions de préparation devraient promouvoir un état conformationnel uniforme. Pour étudier les complexes, il est optimal que leur k D est dans la plage des nM, sinon fixateurs ont été utilisés avec succès pour stabiliser les interactions d'affinité inférieurs 12,13.

Images cryoEM non transformés donnent de précieuses informations sur les dimensions, aperçu général, état d'agrégation / multimérisation, l'homogénéité et la structure interne de la macromolecule. Néanmoins, le potentiel de la technique est largement améliorée par traitement d'image. Une structure 3D montre l'architecture globale de la macromolécule, la localisation 3D de ligands et de sous-unités, des changements de conformation et permet accueil des structures atomiques déterminées par cristallographie aux rayons X ou RMN. La quantité d'informations d'une reconstruction 3D augmente par étapes comme la résolution est augmentée: en général 15 à 20 Å de résolution permet accueil sans ambiguïté des structures atomiques, à 9-10 Å hélices alpha sont visibles que des tiges, à 5 A, il est possible de discerner feuillets bêta, et à des résolutions de 3,5 Å et mieux il est possible de construire un modèle atomique 14.

La possibilité d'obtenir des images d'information et une reconstruction 3D à l'aide SPA de quantités relativement faibles de l'échantillon faire cryoEM Une technique intéressante, que 3-5 ul d'au moins 0,05 mg / ml sont suffisants pour préparer une grille de TEM. Les exigences minimales instrumentalespour cryoEM sont un cryo-plongeur fait maison ou commercial, un microscope électronique à ultra vide, support d'enregistrement d'image et kit à faible dose, un porte-cryo avec sa station de pompage, un appareil à décharge luminescente, et un évaporateur. Les éléments non-essentiels, mais en outre souhaitable sur le TEM sont caméra CCD (présent dans tous les TEM modernes) ou un détecteur d'électrons direct, émission de champ pistolet (FEG), filtrage de l'énergie, et des logiciels de collecte de données à haut débit. Ce logiciel permet en principe la collecte des dizaines de milliers de particules en une seule séance de cryoEM 15, mais les besoins de stockage de données et l'augmentation subséquente supervisé besoin de temps de post-traitement à prendre en considération. FEG combinée avec la fonction de transfert de contraste (FCT) sous-tend correction plupart des reconstructions 3D qui ont atteint une résolution suffisante pour visualiser hélices alpha. À ce moment, le niveau de résolution est également selon l'échantillon: atteindre 10 Å de résolution est moins fréquente pour des protéines membranaires alors que siordre élevé de symétrie est présent, alors la résolution atomique est plus réalisable. Le développement récent de détecteurs d'électrons directs a permis la résolution atomique même pour macromolécules avec une faible (4x) ou pas de symétrie, où la qualité des cartes de densité d'électrons cryoEM correspond à ces dérivés des données de diffraction de rayons X 16,17.

Des exemples pratiques illustrant les capacités de la technique sont fournis ici pour quatre types importants de macromolécules où cryoEM a un rôle principal continue dans leur détermination structurelle. (I) Avec leur symétrie icosaédrique qui augmente l'ensemble de données de 60 fois et leur grande taille qui permet l'alignement fidèle et reproductible, les structures de plusieurs virus icosaédriques ont été résolus à la résolution quasi atomique en cryoEM suivie par 18 SPA. Nous montrons un exemple d'une classe de virus icosaédriques, les virus adéno-associés (AAV), pour lesquels les structures quasi-atomiques par cryoEM et par cryoEM hy / x-rayBrid méthodes existent 19,20. (Ii) macromolécules à structure hélicoïdale comprennent microtubules, filaments et les virus. Leurs unités répétitives le long de l'axe d'hélice peuvent être analysés par une version plus complexe de SPA adaptée à la géométrie hélicoïdale 21. Dans l'exemple, nous montrons le virus de la mosaïque du tabac (TMV), un virus à ARN qui a été réglé à une résolution atomique par cryoEM 22. (Iii) les protéines solubles dans le gros ont été largement étudiés. Parmi ceux-ci, macromolécules formant cylindres multimères symétriques constituent une architecture récurrente souvent résolu à une résolution subnanométrique 23,24. Ici, nous montrons des images de KLH, un transporteur invertébrés d'oxygène, où un modèle moléculaire hybride a été créé à partir cryoEM / x-ray méthodes cristallographie hybrides 25. (Iv) les protéines membranaires sont une classe importante de protéines; ils représentent environ un tiers des protéines codées par le génome humain, mais ils sont difficiles à caractériser structurellement raison de la complexité associés à trstabilisation de domaine ansmembrane 26, constituant moins de 1,5% des structures résolues par ne importe quelle technique de construction combiné. Le rôle de la reconstruction 3D cryoEM et dans leur détermination structurelle est illustré avec le récepteur de la ryanodine (RyR), un grand eucaryote canal Ca2 + intracellulaire important dans la contraction musculaire et la signalisation du cerveau. Les plus hautes structures de résolution cryoEM à ce jour, avec 10 Å de résolution, révèlent la structure secondaire 27.

Protocol

1. Cryo-support Préparation et entretien NOTE: La station de pompage à sec, composé d'une station de pompage de turbo et un ou plusieurs contrôleurs de scène froides, est utilisé principalement pour trois raisons: a) Ce est un endroit sûr pour stocker les détenteurs cryo quand ils ne sont pas utilisés. La bonne façon de stocker les titulaires est de les laisser dans la station sous vide. b) faire évaporer l'humidité et l'accumulation de givre qui se produit lorsque l'azote liquide est retiré du vase de Dewar et le bout du support de cryo est exposée; ceci est réalisé avec le cycle d'échauffement. c) Pour régénérer le déshydratant de zéolithe, et d'atteindre un vide poussé dans les vases de Dewar cryoholder. Ceci est nécessaire pour maintenir une température constante quand faire microscopie électronique à cryo. Cycle Warm-up. Insérer le support dans une cryo des ports de la station de pompage de pompage. Brancher l'un des tubes d'évacuation à la sortie de métal sous la soupape de dépression du support. Faireassurer que toutes les vannes de la station (V1, V2, et V3) et sur le support de cryo sont fermés. Tournez sur le contrôleur de stade froid et le connecter à la porte par le cordon de commande. Allumez l'interrupteur d'alimentation de la station de pompage turbo. Lancer l'option du cycle d'échauffement dans le contrôleur de scène froide. Lorsque le vide dans la station de pompage turbo lit 10 -3 Torr ou mieux, ouvrir la vanne papillon V2, attendre jusqu'à ce que le vide se stabilise, puis ouvrez la vanne V1 papillon. Exécutez le cycle d'échauffement pour environ 30 min jusqu'à ce que la température dans le support est stable au-dessus de 20 ° C. Fermer V1, puis arrêter le cycle. Cycle de zéolite. Exécutez le cycle de zéolite Entre 4 h et O / N avant une session CryoEM, et une fois par semaine si ce ne est en cours d'utilisation. Lancer l'option de cycle de zéolite et sélectionner le temps nécessaire pour atteindre un bon vide dans la plage de 1 à 2 x 10 -4 Torr, et donc longue durée de maintien. Lorsque le vide atteint 10 -3Torr, ouvrir la vanne d'évacuation Dewar, V3. La station de pompage est alors évacuer la ligne sur le support; attendre que le vide se stabilise. Ouvrir la vanne sur le support de cryo. Lorsque le cycle est terminé, fermer les vannes dans l'ordre inverse dans lequel ils ont été ouverts: la vanne sur le support, puis V3, V2, et enfin V1. Éteignez la station de pompage turbo et le contrôleur de scène froide, et débranchez le titulaire de cryo du contrôleur de stade froid et la station de pompage turbo. 2. la préparation de grille Nettoyage. REMARQUE: Lors de l'utilisation des grilles troués commerciales, il est recommandé de les nettoyer avant de les utiliser, afin d'éliminer tout polymère résiduelle qui a été utilisé dans le processus de fabrication. Pour ce faire, dans un plat en verre de Pétri avec cinq couches de papier filtre posé au fond. Placez les grilles sur le papier filtre avec le côté troué de carbone vers le haut. En utilisant une pipette Pasteur en verre, mouiller le papier avec quelques gouttes of chloroforme autour des grilles jusqu'à ce qu'ils commencent juste flottant. Couvrir la boîte de Pétri avec le couvercle légèrement ouvert dans une hotte O / N. REMARQUE: le support de carbone mince (étapes 2.2 à 2.3) peut être omise que la couche de glace peut être formée directement à travers les petits trous dans la grille de carbone troué. En utilisant une paire de pinces, cliver un morceau de mica pour exposer deux nouvelles surfaces. Placez les nouvelles surfaces exposées de mica face vers le haut sur un morceau de papier blanc dans une boîte de Petri. Placez la boîte de Petri dans la cloche d'un évaporateur de carbone. Lancer la séquence de la pompe jusqu'à ce que le vide est inférieure à 2 x 10 -6 Torr. Pour évaporer les impuretés à la surface de la tige de carbone, effectuer une pré-évaporation avec la boîte de Pétri couverte. Puis de l'air de la cloche et retirez le couvercle de la boîte de Pétri. Effectuer la séquence de la pompe jusqu'à ce que le vide est inférieur à 10 -6 Torr et la couche de mica d'une couche mince (~ 5 nm) de carbone. Utilisez des lunettes de protection lors de carboneévaporation. Surveiller l'épaisseur du film de carbone résultant de l'obscurité sur le papier qui avait été placé sous les feuilles de mica. Transférer le carbone mince au TEM Grille. Coupez un morceau de mica recouvert 0,5 x 1 cm et flotter le carbone au loin sur la surface plane de filtration, de l'eau déminéralisée. Utilisez du papier de lentille optique d'obtenir une surface de l'eau plate. Utilisation de la pince à épiler, mettre le côté de carbone à trous de la grille en contact avec la surface supérieure de la couche de carbone flottant et le ramasser. Répétez les étapes 2.3.1 et 2.3.2 jusqu'à ce qu'un nombre suffisant de grilles sont préparés. À décharge luminescente. REMARQUE: La décharge luminescente convertit la couche de revêtement de carbone naturellement hydrophobe des grilles dans hydrophile. Cette étape est facultative. Placer les grilles avec le côté de carbone vers le haut sur une lame de verre de 7,5 x 2,5 cm recouverte de Parafilm. Placez-le dans la chambre de l'équipement à décharge luminescente et fermer la chambre. Pompela cloche et à décharge luminescente pendant 20 sec à 25 mA et 7 x 10 -2 mbar. REMARQUE: Pendant ce temps, une lueur pourpre lumière devient visible. Retirer la lame de verre avec les grilles et les utiliser dans les 1 h, sinon, ils devront être lueur nouveau déchargée. 3. L'échantillon Plunge-congélation REMARQUE: Utilisez des lunettes de sécurité et des chaussures appropriées lors de l'utilisation de cet instrument pour se protéger contre d'azote et de l'éthane projections de liquides. Allumez l'appareil de plongée congélation. Remplir le réservoir de l'humidificateur d'eau distillée. Réglez la température désirée, l'humidité relative et conditions plongeant pour le temps blot, la force Blot et temps d'adsorption (22 ° C, 95%, 2 sec, 2 et 40 secondes dans l'exemple présenté ici). Placez le papier filtre buvard. Refroidir le récipient d'éthane par le remplissage du réservoir extérieur à l'azote liquide jusqu'à ce que la stabilité est atteinte (environ 10 min). Une fois l'azote liquide se arrête boiling, placez le bout du tube provenant du réservoir d'éthane dans la chambre intérieure et ouvrez la soupape très lentement. Liquéfier le éthane dans la chambre intérieure et remplir à 1 mm de haut. Éviter le gel de l'éthane. ATTENTION: l'éthane est extrêmement inflammable et explosive. Assurez-vous que pincettes sont alignés au sein de l'appareil plongeon de congélation. Allumez l'humidité. Chargez une grille sur la pince à épiler, et de charger 3-5 ul de l'échantillon sur la surface de carbone (côté mat) de la grille à trous. Attendre l'échantillon pour adsorber au réseau et effectuer le buvardage de réaliser une couche liquide mince. Flash geler la grille en le plongeant dans l'éthane liquide. Retirez l'ensemble des pinces-grille à partir de l'éthane liquide tenant la pince à épiler régulièrement, et de le transférer à la chambre extérieure avec de l'azote liquide. Transférer la grille pour une petite case de la grille immergée dans l'azote liquide. Assurez-vous de conserver l'échantillon vitrifié dans l'azote liquide tout le temps pendant le transfert soit le réservoir de stockageou sur le support de cryo. REMARQUE: cases de la grille peuvent être stockés dans une grande capacité (35-50 L) Dewar d'azote liquide pendant au moins 1 an. Pour un rangement pratique ils peuvent être placés dans un tube Falcon de 50 ml avec deux trous forés dans la partie supérieure et une ligne de pêche attaché à son bouchon qui peut être tiré de la bouche du vase de Dewar. 4. Transférer le Cryo-TEM à la grille Insérez le support de cryo dans le poste de travail cryo-transfert. Prenez soin de ne pas endommager la pointe du titulaire lors de l'insertion. Vérifier la présence de petites fibres et de poussière sur la tige et le joint torique du support de cryo utilisant une loupe, se il y en retirer avec du papier de verre optique. Remplir le vase de Dewar du support de cryo et le récipient du poste de travail avec de l'azote liquide. Évitez de renverser l'azote liquide en utilisant l'entonnoir piégé qui vient avec le poste de travail. Connectez le support de cryo au contrôleur de scène froide pour surveiller la température, et continuer à ajouter de l'azote liquide & #160; jusqu'à ce que la température se stabilise à environ -194 ° C. Assurez-vous que le niveau d'azote liquide est sous le niveau de l'étanchéité au vide à la fois dans le récipient du poste de travail et le vase Dewar de support de cryo. Pré-refroidir les pinces de la grille, la bague de serrage et l'extrémité émoussée de l'outil de bague de serrage sur le poste de travail. Aussi pré-refroidir un ensemble de grandes pincettes et un tournevis dans un autre vase de Dewar rempli d'azote liquide. Transférer rapidement la boîte de grille cryo contenant les grilles hydratés congelés à l'azote liquide dans le poste de travail en utilisant les grandes pincettes. Ouvrez la boîte de grille de cryo avec le tournevis, prenez la grille hydraté congelé et placez-le dans la fente de support d'échantillon. Placez la bague de serrage sur le dessus de la grille et appuyez doucement avec l'extrémité émoussée de l'outil de bague de serrage jusqu'à ce qu'il soit fermement en place. Fermez le cryo-obturateur. Retirer la boîte d'outils et de cryo grille à partir de la station de travail. Déplacez tout le poste de travail avec porte et la grille à la console de microscope pour mini-Mize le temps de transfert de la grille dans l'air ambiant. Terminez le TEM anti-contaminateur avec de l'azote liquide, qui avait été préalablement rempli et refroidi pendant au moins 20 min. Pré-incliner la platine du microscope à -60 °. REMARQUE: Ceci permet de minimiser la perte d'azote liquide en tant que le support est inséré dans le sas. Commencez le cycle de sas pré-pompe sur le microscope. Assurez-vous que la vanne au canon à électrons est fermé (surtout si ce est un TEM FEG). Attendez que la séquence de sas pré-pompe pour terminer (environ 2 min) avant d'insérer le support de cryo. NOTE: Ceci est indiqué par la lumière rouge sur la scène étant éteint. Insérez le support dans le sas et le faire pivoter de 90 ° dans le sens horaire; connecter le cordon à froid du régulateur de phase sur le support de cryo pour surveiller la température. Attendre jusqu'à ce que le voyant rouge se éteint et faire pivoter la scène et le support dans la position 0 ° à insérer le support dans le salut du TEMgh colonne sous vide. Assurez-vous que la température ne dépasse jamais -160 ° C pour éviter la formation de glace cristalline. Remplissez le vase de Dewar du titulaire de cryo. Attendre 15 à 45 min jusqu'à ce que le titulaire a en équilibre thermique et le vide de TEM a récupéré avant l'enregistrement d'images. Si bouillonnement de l'azote liquide est détecté, changer le liquide hauteur de remplissage d'azote, ou toucher doucement l'origine de bouillonnement avec un coton-tige. 5. Low-dose Collecte de données REMARQUE: La technique de collecte de données à faible dose est utilisée pour minimiser le dommage par rayonnement d'électrons de l'échantillon en limitant l'exposition aux 20 électrons / A 2. Ce résultat est obtenu par l'alternance entre trois configurations: "recherche", à faible grossissement (~ 5000 x) et large champ de vision, "focus", avec un grossissement élevé (~ 150,000X) et petit champ de vue, et «exposition», avec le grossissement final désiréfication et contenant la zone d'intérêt à enregistrer. Blank le faisceau entre les deux modes. Configuration du Programme Low-dose de TEM et Rétracter le cryo-obturation et ouvrir les vannes de colonne. Centrer la scène et régler la hauteur eucentrique (Z) en utilisant le wobbler alpha pour vibrer la scène ± 15 °. Ajustez la position de Z jusqu'à ce qu'il n'y a pas de mouvement appréciable tandis que l'étage est à bascule. Activez le programme à faible dose et sélectionnez le détecteur pour chaque mode. En mode d'exposition trouver une zone de la grille qui n'a pas de carbone, de régler l'éclairement en sélectionnant l'ouverture du condenseur et la tache taille optimale pour que la zone à enregistrer est entièrement allumé. Assurez-vous de répandre le faisceau dans la direction de surcondensation. En mode de recherche, trouver une petite fonctionnalité qui sera facilement identifiable à plus fort grossissement. En mode d'exposition, centrer cette fonctionnalité avec le joystick (le contrôleur de scène xy). Commencez à un grossissement plus faible si l'exploiture se trouve pas dans le champ de vision. En mode de recherche, mettre cette fonction au centre du champ en utilisant les contrôles xy de dose faible de décalage d'image. Aller au mode d'exposition et se déplacer le long de la caractéristique de l'inclinaison à l'aide du joystick axe jusqu'à ce qu'il soit hors de la zone à enregistrer (de 0,5 à 3 microns). Passer en mode concentrer et centrez la fonctionnalité en utilisant les contrôles de décalage d'image xy. Commencer à faible grossissement si la fonction ne est pas dans le champ de vision. Gardez le faisceau centré en tout temps. Collecte de données Rétracter le cryo-obturation et ouvrir les vannes de colonne. Activez le programme de faible dose. En mode de recherche, identifier un carré de la grille contenant fine, la glace homogène. Sélectionnez un trou approprié et le placer dans le centre du champ. Passez en mode Focus et l'image. Puis underfocus l'image entre 0,5 à 4,5 microns. Passez en mode d'exposition et enregistrer l'image. Passer en mode recherche et répétez les étapes 5.2.3-5.2.4.Déplacer à travers la place de la grille évitant pré-exposition de bons trous à enregistrer. Terminer le carré de la grille et de passer à un autre bon. Réajuster hauteur (Z) et poursuivre la collecte de données.

Representative Results

Exécution soignée de toutes les étapes de protocole décrit à la figure 1 permet de visualiser hydratés, des macromolécules non teinté congelés. Résultats pour quatre échantillons représentatifs avec des caractéristiques structurelles différentes sont représentées. Leurs images microscopiques obtenues par les procédés de NS et cryoEM sont comparées (Figure 2). Images (i) de NS AAV5 révèlent particules pseudo-virales de l'ordre de 130 Å de diamètre. La coexistence de structures pleins et vides correspond à cassé (qui permettent l'entrée de la tache) et capsides structurellement intactes, respectivement. CryoEM montre des structures uniformément vides; En effet, ces particules virales ne contiennent pas de matériel génétique 28. NS montre des particules rondes prépondérante, tandis que cryoEM montre des particules de forme hexagonale, reflétant leur forme icosaèdre. (Ii) Les images des TMV montrent tiges hélicoïdales de diamètre 180 Å et de longueur variable, souvent plus de 0,1 um, avec une répétition hélicoïdale de 23 Å visible à la foisen Nouvelle-Écosse et cryoEM. Le canal central 40 Å est rempli de taches dans les images NS et vide dans les images cryoEM. (Iii) Originaire KLH, un didecamer de 8 MDa, assemble dans des fûts de 350 caractéristiques Å de diamètre et de longueur de 400 Å. NS et cryoEM révèlent KLH de vues latérales rectangulaires et circulaires en bout vues. Les deux techniques révèle six stries perpendiculaires à l'axe de symétrie et les unités morphologiques équidistants dans chaque palier. CryoEM révèle une structure interne vide. (Iv) récepteur de la ryanodine, un grand canal intracellulaire tétramérique de 2,26 MDa, est considéré comme un carré de 275 x 275 Å 2. Caractéristiques de surface complexes tels que la croix centrale et une dépression centrale manifeste que l'accumulation de tache en N.-É., et que les régions à plus faible densité par cryoEM. Bien NS montre contraste similaires dans toutes les quatre échantillons testés, la comparaison des panneaux cryoEM expose la SNR inférieur (de contraste) de RyR1 en raison de la présence d'un détergent pour solubiliser cette protéine de la membrane. Des exemples typiques d'artefacts cryoEM sont montrés pour RyR1: la glace cristalline, la contamination de la glace, l'astigmatisme, et les structures en forme de barrettes (figure 3). Leurs causes et la prévention sont décrits plus en détail dans la section de discussion. SPA et 3D reconstruction de congelé-hydraté RyR1 révèle sa structure symétrique quadruplé, ce qui reflète l'organisation homotétramérique de la protéine (figure 4A). Le domaine cytoplasmique forme un prisme carré de 275 x 275 x 120 Å 3 et contient plusieurs domaines globulaires reproductibles formant une structure d'échafaudage-like. Le domaine transmembranaire forme un prisme carré conique plus petit avec des dimensions maximales de 115 x 115 x 60 à 3. À 10 Å de résolution, il est possible de visualiser les hélices alpha (figure 4B). La cartographie différence 3D peut révéler la position des ligands importants, dans ce cas la différence de la carte en 3D FKBP12, une consi 12 kD de la protéinerouge une sous-unité de RyR1, se superpose à RyR1 (figure 4C) 29. Enfin, des changements conformationnels offrent une vue dynamique de la macromolécule. Dans ce cas RyR1 auparavant stabilisé dans des conditions soit fermés ou ouverts révèle une translocation de la masse fermé à l'état ouvert (figure 4D) 27. Figure 1. Diagramme de la technique de microscopie électronique à cryo. Le schéma met en évidence les principales étapes du protocole. Figure 2. Comparaison des NS et cryoEM pour une variété d'échantillons. (A) AAV5, un virus icosaédrique. (B) TMV, un virus hélicoïdale. Encarts montrent la répétition hélicoïdale, du 23 Å. (C) Originaire KLH. (D) RyR1; vues représentatifs sont mis en évidence (f, vue et s quadruple, vue de côté). Tous les échantillons sont imagées dans des conditions à faible dose et au même grossissement d'un 50,000X sous une tension d'accélération de 200 kV. Barres d'échelle, 10 nm. Tous les échantillons NS sont sur ​​support de carbone, des échantillons cryoEM A, C, D sont sur ​​mince carbone sur quantifoil, et l'échantillon B cryoEM est directement au-dessus des trous de quantifoil. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Galerie d'images montrant des artefacts de cryoEM communes sur un échantillon RyR1 cryoEM. (A) cristallin de la glace. Contamination (B) de glace (flèches). (C) astigmatisme. RyR1s dans l'image astigmate sont à peine visibles. L'encart sur la droite montre la SPECT de puissancerhum de l'image avec des anneaux Thon asymétriques. L'encart sur ​​la gauche montre le spectre d'une image non astigmate pour la puissance de référence. (D) structures de Web-like. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. CryoEM 3D et reconstruction du récepteur de la ryanodine. . (A) Représentation Isosurface (B) accueil d'une structure cristalline de ce RyR1 extrémité N-terminale 30 montrant une bonne entente entre les coordonnées atomiques et l'enveloppe cryoEM; flèches indiquent deux hélices alpha qui font saillie à partir de la structure. Pointe de flèche indique l'un des quatre hélices qui entourent le pore du canal d'ions. Les lignes pointillées indiquent les limites de la membrane. (C) et 3D RyR1 location du ligand de FKBP12 (de couleur orange). (D) Les changements de conformation de RyR1 en allant de la fermeture (orange) à la conformation (maille noire) ouverte. 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Discussion

TEM suivie par SPA a contribué de nombreuses structures 3D macromoléculaires, presque 2000 entrées dans le EMDB ici la mi 2014. En général, pour une macromolécule donnée, une structure 3D basse résolution est d'abord déterminé à partir de données NS, qui peut être suivie par un-supérieur la structure résolution cryoEM 3D. Le contraste élevé des limites moléculaires fournies par NS, ce qui facilite la première reconstruction 3D, est ensuite raffiné par cryoEM avec sa capacité à cartographier la structure interne de la macromolécule dans son état complètement hydraté, et la possibilité d'atteindre une résolution beaucoup plus élevée. Un autre avantage de cryoEM est l'élimination de la déshydratation de stress qui pourrait entraîner l'effondrement de la macromolécule. En outre, il est possible d'omettre le support en carbone, ce qui élimine les effets d'absorption de surface possible et qui montre la conformation de la macromolécule adopte en solution. Cryo-coloration négative, une combinaison de cryoEM et NS, offre un contraste élevé dans un cadre entièrement hydspécimen nominale et peut aussi conduire à la reconstruction 3D à l'aide SPA, mais il a été moins fréquemment utilisé, avec moins de 10 entrées de EMDB, en partie parce que la tache se peut interférer avec l'intégrité de la macromolécule 31. Deux autres techniques de TEM propices à la reconstruction 3D sont cristallographie électronique 2D et la tomographie électronique. Cristallographie électronique 2D nécessite une surface plane ou tubulaire cristal; la diffraction d'électrons du cristal est utilisé pour la reconstruction 3D qui pourrait conduire à une résolution atomique 32. En tomographie électronique des échantillons vitrifiés fixes ou Traditionnellement, un composant macromoléculaire ou sous-cellulaire est mis en rotation à l'intérieur du TEM pour la reconstruction tomographique ultérieure 33, avec l'avantage que les objets singuliers peuvent être reconstruites; cependant que cette technique a une limite de résolution allant de 40 à 20 Å 34,35. Parmi toutes ces techniques de TEM moléculaires, SPA de NS et cryoEM données a été le plus largementutilisé. Le protocole illustrée ici est dédié à l'obtention d'images cryoEM appropriés pour l'analyse de SPA; néanmoins la plupart du protocole est également applicable aux cryoEM de cristaux 2D et des échantillons tomographiques.

Une séance de cryoEM succès dépend de la réussite combinée de nombreuses étapes critiques; aspects importants à garder à l'esprit, l'explication des artefacts de cryoEM commun et comment les éviter sont décrits dans les paragraphes suivants. Cette section décrit également des lignes directrices de collecte de données afin d'obtenir des reconstructions 3D de haute qualité en utilisant la méthode SPA.

Évitez transition vers cristalline glace. Un aspect central est que l'échantillon doit rester à l'état vitreux à partir du moment de la cryo-plongeant à travers l'observation TEM. Ainsi, après avoir plongé l'échantillon dans l'éthane liquide toutes les étapes suivantes sont effectuées à l'azote liquide (-196 ° C) ou de l'hélium liquide (-269 ° C) de température. Le réchauffement de -135 ° C au-dessus de l'eau se transforme en vitreuxà l'eau cristalline; puis réarrangements macromoléculaires peuvent avoir lieu et les cristaux d'eau dominent l'image (figure 3A); l'échantillon doit être jetée. Accidentelle échantillon warm-up qui pourrait arriver si cryo-plongée, le transfert de la grille congelé entre les conteneurs (même si elle est protégée par un gridbox), et / ou cryo insertion de support dans le TEM sont trop lent, ou si les pinces de manutention étaient insuffisamment pré refroidi. Détérioration significative de vide dans le TEM sur cryo-transfert (pièges à froid de l'échantillon l'air chaud entrant) peut aussi réchauffer l'échantillon. Enfin, la sur-irradiation de l'échantillon pourrait également entraîner en transition cristallins glace.

Minimiser la contamination de la glace. Étant donné le volume de l'échantillon de petite taille (3-5 pi) appliquée à la grille de TEM, l'évaporation pourrait se concentrer composants tampons (sel, détergents) et donc affecter l'intégrité macromoléculaire y compris la perte de l'état multimère. Une forte humidité relative (HR) microenvironnement ou de la chambre contourners ce problème. Alternativement cryo-plongée peut être fait dans une chambre froide de l'environnement suffisamment ventilé. Après RH de cryo-plongeant doit être aussi faible que possible pour éviter la contamination de la glace ou de condensation de l'humidité ambiante sur le cryo-grille, le cryo-grille elle-même agit comme un piège froid. la contamination de glace se compose de particules avec un contraste élevé et aucune sous-structure avec des tailles allant de ~ 5 nm et plusieurs microns qui interfèrent avec ou même bloquent totalement l'image. Évitez les courants d'air, parler / respiration vers la cryo-grille pendant le transfert de l'air et réduire les RH ambiante. Ouvrez conteneurs d'azote liquide avec de l'eau condensée (visible sous forme de particules en suspension blancs) devraient également être mis au rebut.

Maximisez macromoléculaires orientations / vues. Pour le support de l'échantillon, un choix à faire est entre les véritables grilles troués et mince en carbone plus grilles troués. Cela dépend de (i) la façon dont l'échantillon se étend sur un film de carbone par rapport aux trous de carbone, (ii) d'échantillon disponible concentration, que des trous nus peuvent nécessiter une concentration 100 fois plus élevée que support de carbone pour une densité de particule similaire sur l'image (de ~ 0,02 à 2 uM), et (iii) la façon dont la distribution est aléatoire de l'orientation des macromolécules. Notez que la décharge luminescente, ce qui rend hydrophile de carbone, aura un effet important dans les trois aspects et que ce sera selon l'échantillon. En ce qui concerne l'orientation de la macromolécule, alors une vue récurrent est souhaitable que la détermination de la structure initiale de reconstruction conique aléatoire, aléatoire de vues macromoléculaires est souhaitable lors de l'affinage de la reconstruction 3D à des résolutions plus élevées. Dans notre exemple, RyR1 interagit avec le carbone en vue préférée "quadruple" (Figure 2D) et nécessite grilles de trouées pour le hasard des orientations et une résolution plus élevée 36.

Maximisez SNR. La meilleure stratégie pour augmenter SNR est de réduire les sources de bruit de fond. Excessive de glaceépaisseur et (le cas échéant) l'épaisseur du film de carbone au-delà de ce qui est nécessaire pour soutenir et intégrer la protéine va ajouter du bruit supplémentaire. Ainsi épaisseur de la glace doit être réduite au minimum nécessaire en contrôlant buvard temps, la pression, RH, et la qualité de papier filtre. Pour le support de carbone, une couche mince (~ 5 nm) film de carbone est stratifiée sur le film plus épais de carbone troué: le carbone troué d'épaisseur offre une résistance mécanique tandis que l'échantillon est imagée sur le trou recouvert de carbone mince. D'autre part, notez que la glace très mince et / ou de carbone peut entraîner un support facilement brisée qui peut se transformer en une bande (Figure 3D). Pour maximiser SNR, des composants tampons inutiles doivent être évités. Pour les protéines membranaires, le détergent prend un péage significative sur le contraste (voir la figure 2D, panneau de droite). En outre, en réduisant la tension de surface détergent change la manière dont l'échantillon se propage sur le support. Certaines protéines membranaires nécessitent la présence de lipides en plus de detergent, ce qui réduit encore le contraste. Pour surmonter ce l'échantillon peut être dilué dans un tampon avec une concentration de détergent inférieure et sans lipides juste avant de plonger cryo-37. Nouveaux détergents alternatifs 16 et l'utilisation de nanodisques 38 pour stabiliser le composant de domaine transmembranaire semblent être des méthodes efficaces pour des protéines membranaires de formation d'image par cryoEM.

Se efforcent d'images de haute qualité et à se préparer pour la correction de la FCE. Spécimens vitrifiés requièrent des valeurs élevées de défocalisation pour générer l'image suffisante (de phase) contraste où le FCT, la fonction qui concerne l'intensité à la fréquence, a plusieurs passages par zéro, à quel point il n'y a pas information. Alors que la correction FCT ne est pas nécessaire pour la reconstruction 3D à faible résolution, lors de la visée pour une meilleure résolution, pour récupérer une représentation exacte de l'objet 3D, des images avec différents defoci doivent être recueillies afin que la correction de la FCE de calcul peut être fait.La détermination de la FCE et la correction est inclus dans les principaux logiciels de SPA 4-7; détails peuvent être trouvés ailleurs 39. Pour la correction optimale FCT, utiliser une gamme de defoci. Une bonne stratégie consiste à alterner entre les valeurs de défocalisation 3-4. Les valeurs dépendent de la taille de la macromolécule (tailles plus grandes nécessitent moins de défocalisation), l'épaisseur de la glace / carbone (échantillon mince nécessite moins de défocalisation) et la tension (tension inférieure nécessite moins de défocalisation). Pour 200 kV, une bonne gamme de départ de valeurs est de 2,5, 3, 3,5 et 4 um défocalisation. Le FCT se manifeste comme anneaux de haute et basse intensité alternatif (Thon sonne 40) dans la représentation de l'espace réciproque, le spectre de puissance. Affichage du spectre de puissance va révéler le potentiel de résolution; la fréquence de l'anneau le plus large Thon visible est le plus proche d'une estimation a priori de la résolution réalisable. Le spectre de puissance doit être vérifiée périodiquement, et astigmates (non circulaire) anneaux Thon (Figure 3C) doit être corrigée avec le stigmateur objectif. Thon anneaux devraient être visibles au moins jusqu'à la résolution souhaitée.

Un ensemble de données cryoEM obtenu en utilisant ce protocole peut être directement traité par SPA afin de générer une reconstruction 3D. Même avec un échantillon idéal, la qualité de la reconstruction 3D dépendra de la performance et les caractéristiques de l'équipement de TEM, et sur le traitement d'image. Avec les améliorations continues dans ces deux fronts, et avec mention spéciale aux détecteurs électroniques directs récemment développées, la possibilité d'obtenir des reconstructions 3D à résolution atomique plus cohérente est plus proche qu'il ne l'a jamais été.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Ethane Airgas 371745 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable
Liquid nitrogen Airgas 27135 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers Ted Pella 5326
Mica sheets, 1 x 4 cm Ted Pella 54
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type Electron Microscopy Sciences 70220-45
350 ml cryo-dewars Pope 8600
Cu 400 mesh holey grids  Quantifoil Quantifoil Q10525
Cu 400 mesh holey grids C-Flat Protochips CF-1.2/1.3-4C
Glow discharge device Electron Microscopy Sciences Model E7620
Turbo pumping station Gatan Model 655
Carbon evaporator Denton Vaccum Model 502B
Freeze plunger FEI Vitrobot Mark IV
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
Image Processing software EMAN http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Image Processing software Spider http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
Image Processing software Freealign  http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D visualization software Chimera http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin Biosyn
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Cabra, V., Samsó, M. Do’s and Don’ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (95), e52311, doi:10.3791/52311 (2015).
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