בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
וירוס מוחלש הנילוס המערבי (WNV), (NS) 4B-P38G מוטציה nonstructural, מושרה ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T מסוג wild-WNV בעכברים. לאחרונה, גורם בידול מיאלואידית 88 איתות (MyD88) הוצגה להיות חשוב ליחול תא T ראשוני ופיתוח תא T הזיכרון במהלך זיהום המוטציה WNV NS4B-P38G. במחקר זה, שני לזרום שיטות מבוססות cytometry – במבחנה assay תא T תחול ומכתים ציטוקינים תאיים (ICS) – נוצלו כדי להעריך תאים דנדריטים (DCS) ופונקציות תא T. בתא T תחול assay, התפשטות תאים נותחה על ידי זרימת cytometry הבא שיתוף התרבות של DCs משני הקבוצות של עכברים עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) – שכותרתו תאי CD4 + T של עכברים הטרנסגניים OTII. גישה זו סיפקה קביעה מדויקת של שיעור מתרבים תאי CD4 + T עם שיפור ברגישות לכללית מאשר המסורת באופן משמעותיאל מבחנים עם ריאגנטים רדיואקטיביים. מערכת צינור microcentrifuge הייתה בשימוש בשני הליכי תרבית התאים ומכתים ציטוקינים של פרוטוקול ICS. בהשוואה למערכת מבוססת צלחת תרבית רקמה המסורתית, הליך שינוי זה היה קל יותר לביצוע ברמת בטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים. יתר על כן, טופלו תאים נגועים WNV- עם paraformaldehyde בשני מבחני, שאפשרו ניתוח נוסף מחוץ מתקני BL3. בסך הכל, ניתן להשתמש במבחנה מבחני אימונולוגיים אלה כדי להעריך ביעילות מערכת חיסונית בתיווך תא במהלך זיהום WNV.
Introduction
וירוס הנילוס המערבי (WNV), neurotropic, בתוספת חש-flavivirus, הוא איום על בריאות ציבור מתעורר. נכון לעכשיו, אין חיסונים אושרו לשימוש בבני אדם 1. זן WNV מוחלש, שבו יש תחלופה P38G בחלבון 4B nonstructural (NS), ידוע לגרום לא קטלני בעכברים אבל ציטוקינים מולדים גבוה יותר ותגובות של תאי T בעכברים מאשר wild-type WNV NY99 זן 2. עכברים שחוסנו עם המוטציה NS4B-P38G היו מוגנים מפני כל אתגר המשני עם wild-type הקטלני WNV. הדבר מצביע על כך שיש המוטציה NS4B-P38G תכונות מתאימות למועמד אידיאלי חיסון. המנגנונים שבאמצעותם המוטציה NS4B-P38G גורמת חסינות אדפטיבית מגן גבוהה לא ברור הם הבינו עדיין. קולטנים כמו אגרה (TLRs), אשר מכירים הבקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, ממלאים תפקיד חיוני בייזום של חסינות מולדת לזיהום נגיפי. מסלול איתות TLR ליבה מנצל תגובה הראשונית בידול מיאלואידית gene 88 (MyD88) כמתאם הראשי 3,4. במחקר שנערך לאחרונה, איתות MyD88 הוצגה לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות של חסינות תא בתיווך בזיהום המוטציה WNV NS4B- P38G בעכברי 5. תאי Dentritic (DC) הם אחד מתאי מציגי אנטיגן החשובים ביותר מציגים היכולת הייחודית ליזום תגובות תא T העיקרי בזיהום ויראלי 6,7. CD4 + CD8 + ותאי T הן לתרום לחסינות לטווח ארוכה וחשובים להישרדות מארח בעקבות זיהום WNV wild-type 8,9. שני מבחני אימונולוגיים שמשו במחקר זה להעריך את הפונקציות של תאים אלה בעכברים שעברו מוטציה נגועה NS4B-P38G.
ראשית, assay תחול במבחנה תא T נוצל כדי להשוות את יכולת מציגי אנטיגן של DCs של נגוע WNV wild-type וMyD88 – / – עכברים. כדי להגביר את הרגישות של assay, CD4 הנאיבי <sup> + תאי T היו מבודדים מעכברים מהונדסים OTII, המבטאים ספציפי Vα2 / Vβ5 TCR לovalbumin העוף פפטיד (OVA) 323 – 339. DCs של עכברים נגועים WNV היה מטוהרים, ושיתוף תרבותי עם carboxyfluorescein succinimidyl פסחא (CFSE ) תאי CD4 + T שכותרתו בנוכחות פפטיד OVA. לאחר 5 ימים של התרבות המשותפת, תאים נקצרו וקבוע עם paraformaldehyde (PFA) ונותחו על ידי הזרימה cytometry. מבחני שגשוג בוצעו באופן מסורתי באמצעות שילוב של 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) או deoxyriboside tritiated הטימין (3 HTdr) 10. עם זאת, מבחני אלה הם או רדיואקטיביים ו / או בצורך של ציוד מיוחד ברמת הבטיחות ביולוגית (BL) 3 מתקנים, שבו מחקרי WNV מתבצעים. ניתוח התזרים cytometric של שגשוג לימפוציטים ידי halving הסידורי של עוצמת הקרינה של הצבע החיוני CFSE הפך נפוץ יותר במבחנים חיסוניים כצבע הוא יותר ביציבותושולב באופן שווה לתאים, זוהה בקלות על ידי cytometry זרימה, והוא nonradioactive 11. Assay יש גם את היכולת להעריך את מספר חלוקות תא. אחד יתרונות עיקריים של שימוש assay זה במחקרי WNV הוא שקיבוע של התאים הנגועים ב1-2% PFA יכול להשבית 12 WNV, אשר יאפשר רכישת מדגם עם cytometer זרימה במעבדה BL2.
בשלב הבא, הליך מכתים ציטוקינים תאיים שונה (ICS) שימש כדי ללמוד את התפקיד של MyD88 איתות ברגולציה של תגובות תא T הספציפיות WNV בעכברים הנגוע במוטציה NS4B-P38G. ב assay זה, טופלו splenocytes מבודד מעכברים נגועים במבחנה עם פפטידים ספציפיים WNV. Brefeldin התווסף ללשמור ציטוקינים בתוך התא. אחרי 5 שעות דגירה, תאים נקצרו, שטפו ומוכתמים עבור תת תא T. תאים אז היו קבועים בPFA, permeabilized ומוכתמת לאינטרפרון -γ (IFN) ונותחו על ידי זרימת cytometry.כמו עם assay זרימה אחר מבוסס cytometry, פעם אחת מטופלות התאים עם קיבעון וחיץ permeabilization מכיל PFA, ניתן להעביר דגימות נגועות למעבדה BL2 לעיבוד וניתוח נוספים. במספר מחקרים שפורסמו, השתמשנו ICS למדוד פונקציות מפעיל סלולארי T בעכברים נגוע WNV 13,14. למרות שזה מבוסס היטב, חסרון עיקרי אחד של assay זה הוא שההליך הוא ארוך מאוד ויכול להיות זמן רב יותר כאשר היא מבוצעת בתוך מתקני BL3. כאן, שיטה מבוססת ICS צינור מיקרו צנטריפוגות הוצגה להיות יותר ריאלי, קל יותר להמשיך ופחות זמן רב כאשר היא מבוצעת בתוך מעבדה BL3.
Protocol
Representative Results
Discussion
WNV הוא פתוגן BL3. בשל תקנות בטיחות, מבחני אימונולוגיים עם דגימות נגועות WNV לעתים קרובות מוגבלים על ידי הזמינות של ציוד במתקנים BL3 או יותר ארוכים ומייגע לבצע. במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו בשתי שיטות מבוססות cytometry זרימה ללמוד תגובות חיסוני בתיווך תא במהלך זיהום WNV 5. ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
