先天免疫和癌前细胞间的相互作用使用可诱导的Gal4 / UAS表达系统在斑马鱼幼体皮肤实时成像

在胚胎和幼虫发育，胚胎斑马鱼的皮肤是由两个上皮的层，所述表面层被称为周皮和一层基底角质形成细胞的附着到底层基底膜^19（ 图1C，一 ）。这里介绍的协议描述了一个简单的方法来有条件地诱导在斑马鱼幼体的浅表皮肤层癌前细胞转化，并允许后续的交互分析先天免疫细胞的实时成像。在我们的协议的基本方法，遵循公认的斑马鱼技巧^{9 – 13，}和我们的协议可以很容易地调整和修改。

所述krt4启动子⁵此处使用驱动KalTA4-ER ^T2表达特别是在最外层皮肤层（ 图1C中的B）。然而，模块化多点会议网关克隆策略，用于生成krt4：KalTA4-ER ^T2构建体（ 图1D，a）中 ，提供了克隆中KalTA4-ER ^T2的前面任何感兴趣的启动子在单克隆步骤的可能性。本文中所呈现的方法的一个适应因此，有可能对胚胎和幼虫阶段期间大多数组织中。启动子序列的可用性现的限制因素。此外，克隆的后面一个的UAS兴趣几乎任何基因可以有条件通过使用在空间和时间上受控KalTA4-ER ^T2表达的过表达在不同的发育阶段。因此，我们的协议可以适于在斑马鱼幼体感兴趣的任何组织执行条件的基因表达，在镶嵌的方式。你也可以优化显微镜为了生活图像深层组织如肝胰脏或设置。

我们已经描述了使用协议，他一个应用程序再，同样地，人们可以过表达其他炎症调节剂使用该协议来研究的炎症反应的调节，因为可以很容易地实时图像的中性粒细胞和下列中一个候选炎症调节剂的表达的诱导和巨噬细胞阻滞行为变化。此外，适于协议也将是有益的，谁想要跟踪期间组织形态发生和器官的形成和不同阶段的细胞运动和行为改变，最后实时图像与其他特定细胞谱系的先天免疫细胞相互作用的相互作用，可以有针对性由可诱导的KalTA4-ER ^T2 / UAS表达系统。

我们使用pDestTol2CG向量从斑马鱼Tol2kit ^{20 – 23，}其中包含一个cmlc2：EGFP-pA的录像带（ 图1D，一个 ），它允许随后选择胚胎的绿色荧光积极心中的本质经文标记^20，简化了F0的筛选过程。感兴趣进基因组的转座子侧翼基因的稳定插入由共注射所述质粒DNA一起转座基因促进。质粒DNA的制备和转座基因显微注射遵循标准协议。然而，该构建入基因组的成功整合取决于TOL2基于换位^14。这凸显支付的特别注意无菌条件下冰的工作，以避免污染和退化由RNA酶和DNA酶。显微注射到单细胞阶段的胚胎是一个强大的和成熟的技术用于增益和功能研究的损失在斑马鱼^9,10。虽然一个训练有素的人可以很容易地注入到超过1000的胚胎在1小时的蛋黄中，注入胚盘（ 图1A，星号）需要更多的经验和训练。在此过程中关键的IS中的针的处理。针必须非常薄，以穿透无损伤的细胞，因此具有仅在它的顶端被打破。它定期控制和喷射期间测量液滴尺寸，以保证均匀的注入到每个胚胎是重要的。小心处理，针可被用来旋转胚胎。这通常需要找到胚盘和最优穿透角。

DNA和转座的mRNA用于注射几乎一定的浓度影响表达效率。更高的剂量可导致细胞表达该转基因的增加的比例，但是具有更高的浓度的DNA（> 50纳克/微升）和转座的mRNA（> 100毫微克/微升）也之间注射的胚胎毒性效应的潜力真的出现。我们倾向于使用10纳克/微升DNA和20纳克/微升转座的mRNA注射，其对应于50皮克质粒DNA和每注入EMB​​ 100pg的核糖核酸的坂。胚胎注射这些浓度为100％的人正常发育，和40-70％之间显示EGFP-HRAS ^G12V表达后的4-OHT诱导，这取决于注入效率的单电池。之中阳性胚胎，我们通常发现，具有1-10个克隆约30％，40％具有10-50个克隆和30％的具有多于50个克隆。由于我们的研究目的，我们赞成使用胚胎表达EGFP-HRAS ^G12V较少的克隆。我们选择用胚胎克隆10-50为我们短暂的实验。对于转基因鱼创始人的产生，我们建议，只选择胚胎两者的eGFP阳性心脏标志物，并在其表皮的大量的eGFP-HRAS ^G12V阳性克隆。

（Z）-4-羟基他经历顺-反式（EZ）互当暴露于光^24。结果发现，顺式异构体（E）的100倍以下的抗雌激素比其反式对口^25,26。 Exposur因此E要轻，必须避免。溶解在乙醇中的4-OHT原液可以储存在-20℃下在黑暗中在很长一段时间。我们建议使用一箱保护培养皿从光孵化器和传输中的靶基因诱导过程。虽然成像的面积是非常小的和4-OHT于UV光曝光被降低到最低限度，感应溶液不断地交流，每2小时，同时成像在更长的时间周期，建议以保持最大表达水平。的4-OHT有效permeabilizes通过绒毛膜和期间斑马鱼胚胎发生的最外皮肤层，因此它可诱导基因表达的非常迅速。我们可以在2小时的诱导后容易观察的eGFP发射并且已经报道了靶基因表达的最初迹象可以在1小时高原后3小时治疗⁸后进行观察。该差异可能是由于在我们的研究中所使用的不同的启动子。由于一直公关eviously报道，4-OHT处理是剂量依赖性的^8,27，我们选择使用5μM的最高报道的浓度，以实现我们的瞬时方法鲁棒和可再现的表达水平。这应该保证携带外源基因的所有单元格将诱导靶基因的表达。

它必须被考虑到，这里给出的瞬态方法可能会导致不同的表达水平由于多次和随机基因组插入事件的可能性。此外，在的Tg（UAS：EGFP-HRAS ^G12V）的TOL2转基因背景中使用的转座的mRNA io006可导致所述转基因的UAS可能导致基因沉默或破坏的潜在换位。然而，如这里介绍的方法是一种瞬时的方式，预先选择后续胚胎注射是强制性的。许多实验室已发现的UAS序列往往被沉默在转基因后代，因此在jecting的pTol2-krt4：KalTA4-ER ^T2; cmlc2：绿色荧光蛋白构建成的Tg（UAS：EGFP-HRAS ^G12V）io006胚胎可能不一样有效，注射UAS构建成的Tg（krt4：KalTA4-ER ^T2; cmlc2：GFP ）胚胎。使用稳定的转基因系的Tg：与TG（UAS：EGFP-HRAS ^{G12V）（krt4} KalTA4-ER ^T2）交叉io006将允许一个精确的监测时间剂量依赖性的4-OHT基因激活的通/断的动力学。

幼虫的安装过程中的一个关键步骤是转移到LMP琼脂糖并到达盖玻璃（ 图1B）。只存在于液体LMP琼脂糖温度短时间帧，其允许安全预选幼虫转移和取向，而不由任何热冲击或损害鱼硬化的凝胶。幼虫应直接定向到盖玻璃，以减少用于随后微观ANALY工作距离SIS。因为这可以显微镜中是一个限制因素的适当目标的选择是必需的。一旦安装，幼虫可维持从数小时到数天。

本文介绍的模型系统的条件允许通过4-OHT激活转基因的重复改造。表达系统依赖于4-OHT的存在，因此，所关注的基因的KalTA4控制的表达是可逆的（ 图1D，b）中 。与此相反的酶Cre-ER ^T2 / lox系统，这有利于一个不可逆转的基因组重组事件^{28，KalTA4-ER T2} / UAS可以被激活并在加入或除去的4-OHT停用并且此潜在的重复感应是的一个优点该技术在酶Cre-ER ^T2 /液氧系统。然而，对于4-OHT恒定水平的要求是一个限制，如果在实验，必须从几天延长到几个星期。