À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

La cochlée des mammifères est un organe complexe très ordonnée. Chez la souris, entre l'émergence de l'oreille interne primitif de la vésicule otique le jour E11 et l'achèvement du programme de développement à des stades postnatales, de multiples vagues de signalisation cellulaire et des changements coordonnés dans l'expression génique ont lieu. Exécution de la base au sommet de la cochlée est la détection épithélium sensoriel, ou organe de Corti son. Développement de l'organe de Corti est superbement contrôlé de telle sorte que d'ici la fin du développement, il sera composé d'une seule rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes entrecoupées de cinq rangées de cellules de soutien (deux rangées de cellules de pilier, trois des rangées de cellules de Deiters ^1). Déviation de cette précises résultats d'ordre dans la perte d'audition, heighlighting l'importance de studye DELA genèse et la structuration de la epithemlium sensorielle ^2.

Dans la culture in vitro de l'embryon de souris cochLea est un outil essentiel dans l'étude des mécanismes de développement de l'organe de Corti. Cette technique a été créé en 1974 et au cours des 40 dernières années, a été utilisé pour élucider bon nombre des mécanismes par lesquels l'épithélium sensoriel est spécifié et l'organe de Corti établi ^3. La cochlée est un organe complexe avec les processus dynamiques de développement; une manipulation peut prendre aussi longtemps que sept jours pour manifester ^1. Par exemple, lors de l'ajout d'inhibiteurs de GSK 3β à une culture d'explant cochléaire à E13, la période d'incubation optimal pour observer un effet robuste du composé ⁴ est de six jours.

Imagerie en temps réel de la cochlée développement permet l'étude des changements dans la morphologie de l'organe de Corti, les changements dans l'expression des gènes, le suivi de migration, prolifération ou mourants cellules, et il permet d'observer en temps réel les résultats des agents pharmaceutiques et la perturbation de la signalisation voies. Jusqu'à présent, vivre l'imagerie de la cochléea principalement été effectués en utilisant la microscopie confocale à l'image de petites zones de l'organe de Corti sur des périodes courtes ^5-8, mais cette technique a des limites dues à la viabilité explant. Dans l'imagerie des effets de manipulations à long terme sur les processus de développement lent, le milieu de formation d'image est cruciale. Typiquement, un système d'imagerie confocale en direct utilise une boîte en plastique humidifié qui se trouve sur le microscope. La chaleur et l'humidité peuvent échapper à travers les lacunes dans la boîte incubation où il rencontre la table de microscope, à travers les fenêtres d'accès, à travers les ouvertures à charnières et à travers les interstices autour des différentes parties de la microscope- comme la source de lumière ou objectif. Ce ne sont pas optimales pour le maintien en bonne santé explants pendant plus de deux ou trois jours.

Nous définissons «incubateur microscope» comme un microscope inversé scellé à l'intérieur d'une norme incubateur à _CO2, plutôt que d'un incubateur construit autour du microscope. Un ex incubateur de microscopetend la vie de l'expérience, de telle sorte que, plutôt que l'imagerie sur deux ou trois jours, les échantillons peuvent être imagés par un maximum de deux semaines. Un microscope incubateur offre un excellent environnement pour la croissance et la différenciation cellulaire, avec une perturbation minimale de explantation des cultures et des conditions standard contrôlée. Dans les études qui se déroulent sur plusieurs jours, il est courant de recourir à des échantillons d'imagerie sur une base quotidienne en les retirant de l'incubateur et les portant à un microscope à fluorescence inversé. Bien que cette approche peut travailler, de sortir la vaisselle de l'incubateur inflige une tension sur le tissu développement sensible. Les variations de l'acidité du milieu de culture et les fluctuations de température dues à l'enlèvement de l'incubateur peuvent se traduire par le développement et des tissus sous-optimale malsain. L'imagerie de la même région au même plan focal et dans la même orientation à chaque point de temps est extrêmement difficile. En utilisant un système automatisé à l'intérieur d'un incubateur, il est possible de maintenir en bonne santétissu, de recueillir des images à plusieurs points dans le temps et à veiller à ce que la même zone est capturée dans chaque image. Au cours des dernières années, plusieurs incubateurs de tissus au microscope intégrés ont été développés, ceux-ci ont été utiles non seulement dans la pratique clinique ⁹ mais aussi sur les cellules souches et le cancer recherche ^10,11.

Nous présentons ici un protocole d'imagerie en temps réel à long terme de embryonnaires explants cochléaires de la souris. On utilise un système de microscopie automatisée à l'intérieur d'un incubateur à CO ₂ standard qui est capable de capturer des images de plusieurs échantillons à des instants de consigne. Le système se compose d'un microscope inversé posée dans un incubateur. Les échantillons sont placés dans une estrade tournante qui permet l'imagerie d'échantillons multiples à chaque point de temps. Illumination, capture d'images, et la rotation de l'estrade sont contrôlés par un système automatisé exploité par le logiciel Metamorph. En définissant une routine d'imagerie utilisant le logiciel d'exploitation, nous pouvons définir une expérience à fonctionner jusqu'à two semaines avec une intervention humaine minimale. Dans cet exemple, nous utilisons deux champs lumineux et fluorescence d'afficher une croissance à grande échelle et le réarrangement de la cochlée, et plus précisément, la région prosensory. Dans cette expérience, cochlée sera disséqué de souris rapporteurs Sox2 ^EGFP le jour embryonnaire E13. Cultures in vitro sera établi et imagé sur cinq jours.