טיהור בקנה מידה גדולה של מגזרי בשר חזירים או שור קולטי אור חיצוני למבחני phagocytosis על תאי הרשתית פיגמנט אפיתל

ברשתית, ראייה מופעלת על ידי isomerization של מולקולות רגישות לאור הנקראות opsins, לפני שהפך לאות שניתן להעביר בין הנוירונים עד לאזורים החזותיים במוח. מולקולות אלה מוטבעים בערימות של דיסקים קרומיים הדומים פנקייק, המהווה את החלקים החיצוניים קטע של תאי קולטי אור (PRS). נתון חשיפה מתמדת לאור ולכן רמות ניכרות של סטרס חמצונים, הפורטוריקנים ברציפות לחדש מגזרים החיצוניים שלהם כדי להגביל את נזק חמצוני פוטנציאלי. מגזרים חיצוניים קולטי אור נמצאים בקשר הדוק עם microvilli הפסגה של התאים השכנים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). תאי RPE מהווים חלק החיצוני של מחסום הדם-רשתית ולהבטיח שורה ארוכה של משימות שהם חיוניים לבריאות קולטנית אור ופונקצית ^1, כגון מרווה קרני אור באמצעות פיגמנטים המלנין, מחדש isomerization של רשתית מרכיב opsin photoreactive, חומרים מזינים ומתן growth גורמים, משתתף ברשות המטבוליט יחסי הציבור.

בנוסף, תאי RPE לחסל בילו POS ולמחזר מרכיביהם, כיבוש יומי שמוסדר על ידי מקצב צירקדי ברשתית יונקים ^2,3. האישור של קופה סככה הוא הכרחי להישרדות יחסי ציבור. כאשר הוא ביטל לחלוטין, לצבור פסולת קופה והפורטוריקנים להידרדר גורמים ^4,5 אובדן ראייה מהיר. אם הפרופיל הקצבי הולך לאיבוד והוחלף על ידי פעילות מתמדת, פגמי יחסי הציבור והרשתית לצבור עם גיל ^6. לכן, חשוב מאוד לאפיין את הרגולציה המולקולרית של phagocytosis הרשתית במבחנה כדי להבין פנוטיפים הקשורים לבעיות בתפקודה. מעניין, את המנגנון המולקולרי בתאי הרשתית הוא מאוד דומה לזה המשמש על ידי מקרופאגים כדי לנקות תאים אפופטוטיים ושניהם תלויים בהכרה של phosphatidylserine נחשף בפסולת phagocytic ^7-9. ובכל זאת, תאי הרשתית ומקרופאגים להסדיר phagocytosis שונה, כמו מקרופאגים לבחור לחיסול מיידי של תאים אפופטוטיים בזמן מפגש בזמן שתאי RPE בקצב לבלוע POS רק פעם ביום למרות הקשר הקבוע שלהם עם מגזרים חיצוניים. הדבר מצביע על מנגנוני רגולציה ספציפיים שעדיין אינם מובנות במלואו.

רב של המולקולות מעורבות במכונות phagocytic הרשתית זוהו או תוקף הודות לשימוש בקופה מבודדת ומבחני phagocytosis תרבית תאים. קולט integrin alphavbeta5 ממוקם על פני תא פסגת הרשתית, בתיאום עם יגנד MFG-E8, נקשר באופן ספציפי ^ל10-12 POS, אשר לאחר מכן הם הפנימו באמצעות קולטן טירוזין קינאז MerTK ^13-15. קולט נבלות CD36 הוכח להשתתף בצריכת קופה ולהשפיע על המהירות שלו ^16,17, ועשוי לשמש כחיישן של פוספוליפידים חמצון על פני השטח POS ^18. הפנמה צריכה הגיוס של שלד תא-התחת F- אקטיןחלבוני ociated כגון Annexin 2 ^19, שרירן II ²⁰ ושרירן VIIA ^21,22. POS Native או מתחמצן במבחנה גם מנוצלים להבין פנוטיפים הזדקנות של תאי RPE in vivo קשורים להצטברות של POS מתעכל בצורה גרועה חמצון ^23-28. הדור של תאי RPE שמקורם בתאי גזע יזם בקשה חדשה לקופה מבודדת המשמשים להוכחה פונקציונלי של תאים לפני שהם מושתלים לבעלי חיים או חולים ^29,30,27.

תואר לראשונה על ידי Molday ועמיתים בשינה 1987 ^31, הפרוטוקול לבידודה של קופה שור משלב צעד ultracentrifugation של homogenates רשתית במילויי סוכרוז רציפים עם תצפית של המראה הכתום האופייני לphotopigment רשתית מולבן (ביצוע 11- רשתית cis). בעבר 10 השנים, בשל אמצעי זהירות שננקטה על מנת לצמצם את הסיכון של מחלת פרה משוגעת, שימוש בעיניים חזיריות הפכו increasingly בולט. הפרוטוקול המתואר כאן מראה כיצד להשיג כמויות גדולות של POS מחזירי או עיני שור שניתן aliquoted ומאוחסנים לפרקי זמן ממושכים. זו מבטלת את הצורך להכין POS מעיני מכרסם, המחייב שימוש במספר רב של בעלי חיים להכנת POS וassay ^32,33,21,22. בנוסף, פרטים על תיוג POS לפני האחסון באמצעות מולקולות ניאון ניתנים, לכמת ולחזות POS באופן פשוט ובר-השוואה ליישומים מסוימים בהשוואה לקופת תיוג לאחר assay phagocytosis ^32,10. לכן, מניות הגדולות אלה מאפשרים לשחזור וקלות שימוש בסוגים רבים ושונים של ניסויים.