문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드
Summary
The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
Abstract
1970 년대 말은 웨스턴 블롯, 존재와 복잡한 생체 시료 내 특정 단백질의 상대적인 풍요 로움을 평가하는 기술의 첫 번째 공식보고 사용을 보았다. 그 이후로, 웨스턴 블로 팅 방법은 분자 생물학 실험적인 레퍼토리의 공통 요소가있다. 용어는 "웨스턴 블롯"을 사용하여 PubMed에의 피상적 검색 이십이만 출판 원고를 초과 중요한 것은 2014 년에이 기술의 사용을 만든 것을 제안, 지난 10 년은 개발과 함께 기술 이미징의 발전을 보았다 감도 개선 및 선형 검출 더 큰 범위를 산출 한 민감한 형광 라벨. 결과는 생물 학자들이 이전보다 민감도와 정확도를 비교 발현 분석을 수행 할 수 있습니다 웨스턴 블롯 (Western Blot) (QFWB)을 기반으로 지금 진정으로 계량화 형광입니다. 많은 "최적화"서양 블롯방법론이 존재하고 서로 다른 실험실에서 사용된다. 이들은 종종 인해 미묘하지만 문서화되지 않은 절차 개정의 요구에 구현하기 어려울. 이 프로토콜은 문제 해결 전략을 완성 설립하고 강력한 QFWB 방법의 포괄적 인 설명을 제공합니다.
Introduction
웨스턴 블롯 (WB)는 원래 같은 조직 파쇄 한 바와 같이, 복잡한 생물학적 샘플에서 목적 단백질의 존재 여부를 결정하기 위해 1970 년대 후반에 개발 된 분석 기술이다. 일반적으로 인해 키 항체 – 항원 상호 작용, 단백질 면역라고, 방법론은 5 별개의 단계로 구성되어 자신의 등전점에 의한 단백질의 1) 전기 영동 분리; 2) 니트로 셀룰로오스 또는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인로 전송; 3) 관심 단백질에 특이 차 항체를 사용하여 라벨링; 차 항체에 대항 차 항체 4) 배양; 5) 시각화.
시각화 방법론은 안전과 감도를 개선하기 위해 시간이 진화하고있다. 첫 번째 WBS의 일부는 더 널리 사용 chemilluminescent (ECL) 방법 색채와에 진행 라디오 라벨 태그를 사용하여 수행되었다. Radioactivi비색과 ECL 방법은 알칼리 포스 파타 아제 또는 스트렙 타비 딘 고추 냉이 과산화 효소 (HRP) 2 등의 효소 기자와 간접 라벨링 기술을 사용하는 반면 타이 직접 특정 항원에 대한 프로브에 표지 하였다. 크로마 또는 발광 제품 라벨의 강도가 강하거나 약한 신호 강도는, 샘플에 관심 단백질의 다소간 존재를 나타내고있다 농도계를 사용하여 측정한다. ECL은 더욱 민감하고, 따라서이 방법론 선호되지만 3 방법은 초기에이어서 3 확립보다 정교한 디지털 이미징 기술로 엑스레이 필름이 개발되었다. WB의 디지털 이미징의 발전뿐만 아니라 그들의 관심 단백질의 존재 여부를 결정하기 위해 연구를 허용하지만, 다른 샘플과 비교할 때, 또한 선택된 단백질의 발현 수준에 대한 추론을 허용하고, 따라서로 지칭 될 수있다 "반 정량적 & #8221 ;. 측정 된 형광의 레벨을 직접 시료 내의 수량 및 단일 단백질의 발현과 관련된다 최근 진정한 정량적 더 민감 웨스턴 블럿 기술이 개발되었다 : 정량적 (QFWB) 웨스턴 블로 팅 형광등.
ECL 표지와 QFWB를 비교하면, 형광 이차 항체의 사용은 선형 검출 프로파일 (4)를 생성한다. 이것은 신호 선형성 일반적 도처 발현 하우스 키핑 유전자 5,6로, 즉, 직접 단백질 발현과 관련된 5 μg의 신호 포화 아래 낮은 단백질 부하 발생 ECL 기법 대조적이다. 이 불균형은 대부분 전위 신호 포화의 높은 가능성의 결과로, 보조 바이오틴에 결합하는 아비딘 ECL 기판에 사용할 결합 부위의 수에 의해 크게 유발된다. 이것은 같은 ONL 지칭되는 ECL베이스 면역의 주된 이유 중 하나이다Y "반 정량적"7. 발현 수준에서의 미묘한 차이를 측정하고 측정에 부정확을 초래할 수있는 경우 신호의 포화 점은 매우 중요하다. 최근 몇 년 동안 계속 증가하는 민감도와 미묘한 표현 차이의 식별을 자세히 널리 프로테오믹스 기술의 출현은 검증 실험 8,9에 대한 진정한 양적 웨스턴 블로 팅에 계속 증가하는 의존 가져왔다. 민감한 강력한 진정 정량적 방법론의 적용은 따라서 중요하다.
많은 "최적화"서양 블롯 방법은 자주 인해 공식적인 문서화 된 프로토콜에서 쉽게 보이지는 미묘한 방법론 조정을 설정하거나 복제하기 어려울 독립적 인 실험실에 의해 이용되어왔다. 이 QFWB에 설립하고 강력한 프로토콜이며 추가로 일반적인 문제 그쪽으로 문제 해결을위한 유용한 전략을 제공합니다T 구현시 발생할 수 있습니다.
이 프로토콜은 원래 쥐의 뇌 균질 물과 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만, 이후 조직 샘플과 종 4,9,10의 넓은 범위에 걸쳐 효과적으로 사용되어왔다. 특정 문제를 해결하기 위해 필요한 잠재적 인 프로토콜의 변화가 포함되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
등을 고려해서 계획은 실험에 앞서 필수적이며 궁극적으로 사용 된 기술의 성공 여부를 확인할 수 있습니다. 적절한 항체, 전송 및 시각화 방법을 사용하기로 선택하려고 할 때 잠재적 인 장애물의 과다를 제공 할 수 WB를 사용하여 단백질 검출 발전. 다행히, 단백질의 존재와 샘플 사이 점점 더 미묘한 표현의 차이를 결정하기 위해 일상적으로 사용할 수있는 QFWB주의 깊게 점검하고 적절한 통제 수단을 사용. 이 프로토콜은 방지 및 / 또는 그와 관련된 많은 일반적인 함정 중 일부를 극복하기 위해 형광 양적 서부 모래 바닥뿐만 아니라 몇 가지 문제 해결 전략에 포괄적 인 가이드를 제공합니다.
감도를 유지하고 획득하기 위해 사용되는 중요한 단계는 진정으로 정량화 및 비교 측정은 다음과 같습니다 : 조직 샘플에서 1) 강력한 단백질 추출; 2) 샘플 준비; 3) 정확한 단백질 loading는 총 단백질 분석에 의해 측정; I-의 얼룩을 사용하여 단백질의 4) 최적의 전송; 열전달 및 관련 소프트웨어를 사용하여 0.1 % 트윈 20을 포함하는 버퍼를 차단하는 일차 및 이차 항체의 5) 준비, 6) 올바른 시각화 및 분석.
적외선 형광 검출은 진정으로 정량적이고 전통적인 ECL 검출 기법 3,11에 비해 민감도를 제공한다. 이 검출 시스템은 여러면 처리이며, 같은 QFWB에 한정되지 않는다. 이 시스템은 전체 조직 절편 (12)의 시각화 및 정량화를 허용 저전력 면역 조직 라벨링 촬상 할 수있다. 이 정량적 평가의 측면에서 기존의 현미경과 기존의 면역 캡처 필적까지 빨간색 영상을 볼 수 있었다 해상도의 측면에서 잠재적 인 미래 개발의 한 영역이다.
그러나, P의 미묘한 변화에 대한 민감도와최소 제어 조치를 유지 표현이 변동성을 보장하기 위해 매우 중요합니다 rotein하는 강력한 프로토콜과 엄격한이다. 이 샘플 로딩이 균일 검색이 현실과 관련하여 제조업체의 지침을 테스트하는 것은 전송하는 것입니다 여부를 결정하기 위해 기본 및 보조 항체의 최적화임을 보증을 제공하기 위해 총 단백질 스테인드 젤의 생산 다음에 조직 샘플에서 엄격한 단백질 추출로 시작 시간 효율적인 단백질 전달을 얻었다.
그럼에도 불구하고, WB의 조건이 최적화되는 경우에도, 여전히 문제가 완전히 여기에 탐험되지 않았을 수 있습니다 서부 실행과 관련이있다. 이들은 다음을 포함하지만, 단백질의 가용화 및 추출 완충액의 선택 등 다양한 요인에 한정되지 않는다. 일부 버퍼 단백질 농도 분석을 방해 할 수 있지만, 몇몇 조직은 자동화 macera의 사용으로 더 강력한 기술을 필요로 용해하는 것이 특히 어렵다팅은 맥의 dissociator과 함께 M 튜브 등의 용기를 밀봉. 또한, -80 ° C에서 추출 및 비 추출 된 물질의 저장을위한 간단한 제어 조치를 즉시 추출 후 최적의 라벨을 획득하고 가난한 결과 주 후 가진 사이의 차이가 될 수 있습니다.
현대 QFWB 방법은 단백질 발현에 미묘한 차이를 캡처 더 민감한 것으로 입증 및 ECL 같은 이전의 기술과 비교했을 때 더 융통성 동시 듀얼 라벨 3을 허용한다. 그것은 서양 블로 팅 프로토콜이 강력하고 정확한 정량 및 통계 분석을 위해 쉽게 반복적 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 서로 다른 조직 샘플 종 (3)의 종류에 걸쳐 단백질의 검출을 위해 일상적으로 사용하기에 민감하고 강력한 충분히 따라서 실험 1 당 소비 사용량뿐만 아니라 시간을 감소 동일한 QFWB 내 로우 및 하이 풍부 단백질의 정량화를 허용. 9,14 그러나 정확성함으로써 잘못된 데이터 수집을 방지하기 위해 준수해야 중요하고 적절한 통제 조치의 포함이다 오믹 연구 – (1) 또한,이 기술의 증가 감도는 점점 더 인기를 검증 할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 덕분에 금융 지원을 위해 다음과 같은 것이다 : BBSRC 연구소 전략 프로그램 기금 – CF 및 TMW을; BBSRC 동부 바이오 DTP 자금 – LG; 에딘버러의 다윈 신뢰 – MLH. 우리는 또한이 원고의 TREM2 최적화를 포함 할 수있는 권한에 대한 박사 배리 맥콜에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
| SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
| NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
| PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
| iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
| InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
References
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