Визуализация Номера для литическую экзоцитоза<em> Cryptococcus neoformans</em> От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии
Summary
Мы опишем, как визуализировать macrophage- C. neoformans (Сп) взаимодействия в режиме реального времени, при этом особое внимание на процесс не-литической экзоцитоза с использованием цифровой световой микроскопии. Используя эту технику индивидуально зараженные макрофаги могут быть изучены, чтобы установить различные аспекты этого явления.
Abstract
Многие аспекты инфекции макрофагов по Cryptococcus neoformans были широко изучены и определены. Тем не менее, один частности взаимодействие, что не ясно понимать, не является литическую экзоцитоз. В этом процессе, дрожжевые клетки высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью механизма плохо понимаемой, что оставляет как макрофаг и Сп жизнеспособным. Здесь мы опишем, как следовать большое количество индивидуально инфицированных макрофагов для 24 часами инфекции периода по времени истек микроскопии. Зараженные макрофаги расположены в нагревательной камере с CO 2 атмосферы, прикрепленной к микроскопом, который обеспечивает те же условия, как и культивирования клеток инкубатора. Онлайн цифровая микроскопия может предоставить информацию о динамических взаимодействий между организмом хозяина и возбудителем, недоступной из статических изображений. Будучи в состоянии визуализировать каждый инфицированной клетки могут дать ключи, чтобы, как макрофаги справиться с грибковыми инфекциями, и наоборот. Эта техника яса мощным инструментом в изучении динамики, которые находятся за сложного явления.
Introduction
Этапы грибковой инфекции между криптококковых клеток и макрофагов, хорошо документированы 1-3. После дрожжевые клетки поглощаются макрофагами, различные взаимодействия может произойти: макрофагов может лизировать выпуская его грибковой нагрузки во внеклеточное пространство, или он может контролировать инфекцию, сохраняя дрожжевых клеток в пределах своей клеточной мембраны 4. Тем не менее, несколько лет назад новый результат был описан независимо друг от друга две группы: не-литическую экзоцитоза, процесс, в котором макрофагов исключены некоторые или все из криптококковых клеток в окружающую среду или соседней соте, и оба хоста и возбудитель остаются жизнеспособными 5 -8. Несколько исследований пытались понять молекулярные механизмы, лежащие в этом взаимодействии, но мы до сих пор не имеют полное представление о том, что движет этим явлением.
Возможность захвата изображения в режиме реального времени, а затем впоследствии проанализировать несколько инфицироватьред макрофаги позволяет ответить на многие вопросы о физических свойствах окружающих не-литическую экзоцитоз в отношении сроков, пространственного потенциала, изменения в морфологии и даже стресс макрофагов во грибковой инфекции. По позволяя клеткам быть размещены в среде, которая сравнима с инкубатора, мы можем увидеть динамическую природу макрофагов-грибковые взаимодействий клеток. Исследователи использовали эту технику для изучения различных компонентов этого процесса. Роль фагосомы в этом процессе было сделано очевидным использованием флуоресцентного окрашивания и актин блокаторов 9, в то время как другая группа использовал этот метод, чтобы показать, что не-литический экзоцитоз был заблокирован в клетках, которые имели WASH нуклеирующий белковых доменов удален 10. Эффект цитокинов сигнализации также было установлено при помощи в режиме реального времени микроскопии 11. Этот процесс не ограничивается C. neoformans, как это наблюдалось также с Candida Albicans, соседнийг грибкового патогена, который имеет возможность инфицировать макрофаги 12. Эти данные приведены примеры, как этот метод может обеспечить большой объем информации в области, которую мы так мало знаем о.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали метод, посредством которого грибковые-макрофагов взаимодействия могут быть записаны и проанализированы в реальном времени в течение 24 час. Наша лаборатория использует этот протокол для изучения многих временных аспектов не-литической экзоцитоза и будет продолжать и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержана NIH наград 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum ( FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss | ||
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
