La interferencia de ARN de las larvas en la Red Escarabajo de Harina,<em> Tribolium castaneum</em

1. T. Acciones castaneum y cultivo Decidir sobre una T. cepa castaneum a utilizar para el experimento. NOTA: Varios T. lab-establecido castaneum cepas están disponibles. Ga-1 (Georgia-1) es la cepa parental de Ga-2 que se utilizó para la secuenciación del genoma 3. Desde Ga-1 comparte la mayoría de los polimorfismos de ADN (tales como polimorfismos de un solo nucleótido, SNP) con Ga-2, y es más saludable que Ga-2 debido a la menor endogamia, es ideal para los experimentos de RNAi. Pu-11 es otra cepa cómodo de usar , como su expresión amarilla mejorada única proteína fluorescente (EYFP) en el futuro primordios ala nos permite distinguir el último estadio larval de otros estadios (ver Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 12). Es importante documentar que escarabajo cepa se utilizó en el experimento, como fondos genéticos parecen significativamente affect del RNAi fenotipos 13. Preparar T. castaneum harina de cultivo mediante la adición de 5% (en peso) de la levadura de cerveza previamente tamizada a la harina de trigo integral orgánica (después de mezclar, almacenar la harina de la cultura a -20 ° C). Alícuota de la harina de cultivo (a temperatura ambiente) en 6 botellas de valores Drosophila oz de plástico (alrededor de 40 g / botella). T. Cultura castaneum a 30 ° C con 70% de humedad. Utilice una incubadora con humedad controlada, si es posible. Añadir 30-40 adultos por botella de cultivo (razón hombre: mujer 1: 1) para iniciar el cultivo. NOTA: Aunque el moho es rara vez un problema a 30 ° C, temperaturas más bajas (por ejemplo, 25 ° C) con un 70% de humedad puede causar el crecimiento de moho en la harina de la cultura. Baje la humedad si esto ocurre. La transferencia de los adultos a un nuevo frasco de cultivo cada dos semanas durante el subcultivo (véase el paso 5.2 a 5.5 para cómo aislar los adultos a partir de harina de cultivo). NOTA: Se tarda unas tres semanas para obtener el último estadio las larvas. Alternativavamente, T. culturas castaneum se pueden mantener a una temperatura más baja (20-25 ° C), aunque con un período de cultivo más largo (tiempo de desarrollo a 25 ° C es aproximadamente el doble que a 30 ° C). 2 Preparación de Soluciones e Instrumentos para larvas inyección de dsRNA Sintetizar moléculas de dsRNA homólogos al gen diana por transcripción in vitro. Almacenar a -80 ° C. Ver Felipe y Tomoyasu 2011 11 para los procedimientos de biología molecular detalladas. Véase también la discusión de una serie de parámetros que deben tenerse en cuenta en el diseño de moléculas de dsRNA. Hacer 10 ml de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C) mezclando 8,5 ml de 1 M Na 2 HPO 4 con 1,5 ml de 1 M NaH 2 PO 4. Comprobar el pH con un medidor de pH y ajustar en consecuencia. Hacer 1 ml de tampón 10X de inyección mediante la mezcla de 10 l de tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6; l de 0,5 M KCl, 100 l de colorante alimentario verde, y 790 l de agua doblemente destilada (ddH2O). Diluir el tampón 10x inyección para hacer 2x tampón de inyección (200 l de 10x tampón de inyección + 800 l ddH 2 O). Almacenar tanto 10x y 2x de inyección de tampones a 4 ° C hasta que se necesite. Preparar Sticky Glass Diapositivas. Cubrir un portaobjetos de vidrio entero con una forma de pegamento reposicionable para inyecciones larvales. Para adultos y pupas inyecciones, hacer dos finas tiras de pegamento a lo largo de los bordes más largos de la diapositiva. Deje que el pegamento se seque durante varios días, lo que garantiza que el pegamento se mantiene lo suficientemente pegajosa para adherirse escarabajos a la diapositiva, al mismo tiempo de ser lo suficientemente flexible para facilitar su eliminación después de la inyección. NOTA: Si el pegamento se queda demasiado pegajoso, utilice un dedo y toque en la cola, lo que reducirá la pegajosidad. Cada diapositiva puede contener hasta 40 o 50 escarabajos, y puede ser reutilizado hasta que falla para sujetar los animales. Alterntivamente, cinta de doble cara también se puede utilizar, aunque la cinta se veces no adhesivo suficiente para mantener las larvas. Hacer una cesta eterización. Retire el émbolo de una jeringa desechable de 10 ml, y cortar la jeringa por la mitad alrededor de la línea 6 ml. Deseche la mitad inferior de la jeringa. Calentar brevemente la superficie de corte de la parte superior de la jeringa con un quemador de gas, y empujar rápidamente el plástico derretido en una pieza de malla de nylon para pegar la malla en la jeringa. Recorte cualquier exceso de malla una vez que el plástico se endurece. Preparar la botella de éter. Añadir 30 ml de éter en una botella de vidrio de 100 o 250 ml de boca estrecha. Añadir varias piezas de papel de seda para mejorar la evaporación del éter. NOTA: Éter presenta un peligro de incendio y también es perjudicial. Siempre maneje éter bajo una campana de humos. Cierre la tapa bien mientras no esté en uso. NOTA: El hielo puede ser utilizado como una alternativa más segura (tal como en un salón de clases), aunque la Sedation es menos eficaz. 3 Preparación de larvas aparato de inyección Publicar un platina mecánica XY en un microscopio de disección. NOTA: etapas XY mecánica están disponibles en las principales compañías de microscopio. Alternativamente, las etapas de microscopio de bajo costo también se pueden utilizar para la mayoría de los microscopios de disección con algunas modificaciones (véase la Tabla de Materiales por ejemplo). Coloque un manipulador de aguja mecánica cerca de la platina mecánica XY. Montar una jeringa de inyección. Utilice una llave de paso de cuatro vías (con conexiones Luer) para conectar una jeringa desechable de 30 ml a un soporte de aguja de vidrio, lo que permite la manipulación de la jeringa de inyección sin afectar a la presión en la aguja de inyección (véase Philip y Tomoyasu 2011 11 para la jeringa de inyección detallada montaje). 4. Tirando agujas de inyección Tire las agujas de vidrio borosilicato (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm de longitud) por unextractor de aguja. NOTA: Para Sutter P-87 o P-97, use el ajuste "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tiempo = 90" o seguir el capítulo 2 de la pipeta Cookbook: Adherente Cell, C. elegans, Drosophila, pez cebra y – programas recomendados. Los ajustes óptimos varían en función del modelo de la aguja extractora. El escenario de una aguja de inyección genérica Drosophila es un buen punto de partida. Tienda sacó agujas en una caja de plástico (por ejemplo, una caja de CD de plástico) y seguro con extraíble masilla de montaje. 5. Aislamiento y Selección de las larvas Coloque un tamiz # 25 en un receptor tamiz. Coloque el contenido de la botella de cultivo (escarabajos y harina de cultura) en el tamiz, y tamizar el contenido inmediatamente. No dejar el contenido en el tamiz sin tamizar, como larvas tratará rápidamente para excavar a través del tamiz y se atascan. Tamizar agresivamente los contenidos para que la caída de harinaa través y dejar las larvas más viejas (por lo general 6 y 7 de larvas), pupas y adultos (junto con sus cutículas desechadas, exuvias) detrás en la parte superior de la criba. Transfiera los materiales restantes en el tamiz (escarabajos y exuviae) a la bandeja de la semilla. Siga punteando en la sartén para evitar que los escarabajos se escape. Retire la exuvia y las partículas de harina restante sobre la superficie de los escarabajos soplando suavemente sobre la sartén semilla. Pulse la sartén semilla para mover el contenido a la parte inferior de la sartén. Luego, deje el pan sin explotar durante varios segundos. Espere a que los adultos, que son más móviles que otras etapas, a salir de la pila. Retire los adultos mediante el uso de un pincel de arte (por ejemplo, 1 cm de ancho). Pupas independiente golpeando suavemente la bandeja de semillas mientras se mantiene la boca de la sartén ligeramente hacia abajo, como pupas tienden a rodar más rápido hacia la boca. Utilice un pincel para eliminar las pupas, dejando sólo las larvas en el platillo de la semilla. Plas de las larvas aisladas en una placa de Petri limpia. Seleccione una etapa apropiada de larvas para inyección y colocarlos en un plato aparte Petri. NOTA: larvas de último estadio temprano (1-2 días después de la muda larval final) A menudo son adecuadas cuando se analiza el efecto de RNAi en morfologías de adultos, así como en la metamorfosis. Es, sin embargo, a veces es necesario para llevar a cabo RNAi en la penúltima (o incluso antes) etapa para evaluar la función del gen temprano (por ejemplo, las figuras 3E-3H. También véase Clark-Hachtel et al. 2013 12). Utilice pupas como una referencia para identificar el tamaño de las larvas de instar. El último estadio las larvas son ligeramente más largas que las pupas. Alternativamente, pu-11 puede ser usado para identificar el último estadio las larvas, así como para determinar el curso temporal del desarrollo de larvas de último estadio (Figura S4 de Clark-Hachtel et al. 2013 12). Mantener las larvas seleccionado en una placa de Petri hasta eterización. Coloque el restode larvas y otras etapas de escarabajos (como pupas y adultos) de nuevo en una botella de cultivo con harina y devolverlo a la incubadora. 6 Preparación de agujas de inyección Coloque una aguja de vidrio previamente tirado sobre un portaobjetos de vidrio utilizando tachuela pegajosa o cinta de doble cara. Con unas pinzas, se examinará el tirado de la aguja mientras mira a través del microscopio de disección para ver donde las curvas de punta. Coge la zona un poco hacia el lado de la punta de donde las curvas de aguja con las pinzas y giro para romper. Mantenga buenos agujas y desechar otros. Considere una buena aguja como que tiene una abertura que no es ni demasiado grande ni demasiado pequeño (alrededor de 0,05 mm de diámetro. Figuras 1A y 1B), y está en ángulo para hacer la penetración de la cutícula de las larvas más fácil (Figuras 1B y 2A-2B). Considere la posibilidad de un mal aguja como (i) demasiado pequeña, por lo que la absorción de la solución de dsRNA en la aguja dificulto (paso 7) (Figuras 1D y 2D), (ii) demasiado grande, causando daño de las larvas y la posible letalidad después de la inyección (Figuras 1C y 2F), (iii) romo, lo que hace difícil la penetración de la cutícula y el aumento de la lesión. Inserte la aguja en el porta-agujas. En primer lugar, desenroscar la punta del soporte de la aguja y colocar el extremo posterior de la aguja en la punta soporte. A continuación, colocar la junta de goma debajo de la punta soporte (por lo menos 1 cm del extremo posterior de la aguja de vidrio). Inserte la parte posterior de la aguja en el soporte, con la junta de goma completamente insertado en la abertura del soporte de la aguja. Enrosque la punta de nuevo en el soporte. Coloque el soporte de la aguja montada sobre el manipulador de la aguja. Mantenga el soporte de la aguja cerca de la horizontal. Ajustar la posición del manipulador, por lo que la punta de la aguja se encuentra en el centro de la vista cuando se mira a través de la microscope. 7. Solución Frontloading dsRNA en la Aguja Preparar la solución de inyección de dsRNA justo antes de la inyección mediante el ajuste de la concentración con ddH 2 O y la mezcla de la solución de dsRNA con volúmenes iguales de tampón de inyección 2x (paso 2.3). Guarde la solución mezclada en el hielo. Véase la discusión con respecto a la concentración de ARN de doble cadena. Cortar la punta de una punta de pipeta desechable 20 l. Pipetear 10 l de la solución en la punta de pipeta recortada. Retire cuidadosamente la punta de la pipeta de la pipeta mientras se mantiene el fluido en la punta al proporcionar contrapresión. Alternativamente, retirar cuidadosamente la punta y luego pasar la solución al extremo de la punta, proporcionando la presión con un dedo. Coloque la punta de la pipeta con la solución de dsRNA en la platina del microscopio usando la tachuela pegajosa con la abertura hacia la punta de la aguja. Mirando a través del microscopio, mueva lentamente la punta cargado hacia la aguja hasta que la punta de laaguja está justo dentro de la punta de la pipeta cargada y en la solución. Mientras mira a través del microscopio, tire suavemente el émbolo de la jeringa de inyección para extraer lentamente la solución de ARN de doble cadena en la aguja. NOTA: No sobrecargue la aguja. Como el final de la solución de dsRNA se aproxima a la punta de la aguja, reducir la tasa de tracción y detener la carga de la solución antes de la punta de la aguja alcanzaría aire. Si el aire llega a la punta, la solución se extrae rápidamente en el soporte de la aguja, lo que resulta en problemas de contaminación graves. Los procedimientos detallados de limpieza del soporte de la aguja se describen en Felipe y Tomoyasu 2011 11. Retire la presión de la jeringa de inyección y de soporte de la aguja con la apertura de la llave de paso. A continuación, mover la punta de pipeta de distancia desde la punta de la aguja. Levante la aguja a partir de la etapa para evitar dañar accidentalmente la aguja al colocar las larvas en el escenario. Retire la punta de la pipeta vacía desde el escenario. </ol> 8. inyección de dsRNA Coloque las larvas dentro de la canasta eterización. Utilice menos de 10 larvas si el aprendizaje de la técnica. Utilice 30-40 larvas en la primera ronda, una vez familiarizado con la técnica. Coloque la canasta con larvas en la botella de éter y cierre la tapa. NOTA: Éter presenta un peligro de incendio y también es perjudicial. Realice este paso bajo una campana de humos. Larvas Etherize durante unos 3 min. Compruebe las larvas para el movimiento después de 3 min. Coloque de nuevo en la botella de éter durante otros 30 segundos si todavía se están moviendo. No Etherize durante más de 5 minutos, ya que esto puede aumentar la letalidad. NOTA: El tiempo óptimo eterización puede variar dependiendo de la temperatura y la humedad. Transferir las larvas anestesiado de la canasta hasta el borde antiadherente de un portaobjetos de vidrio pegajosa. Con unas pinzas, y mientras mira a través del microscopio, recoger las larvas cada uno por uno y colocarlos en la diapositiva. Colóquelos lateralmente y golpear suavemente hacia abajo sus cuerpos from cabeza a la cola con el fórceps, que se extiende ligeramente a medida que avanza, para asegurarse de que están asegurados en la diapositiva. Colocar la placa pegajosa con larvas en la platina del microscopio. Insertar la aguja cargada dsRNA suavemente en el lado dorsal de las larvas para evitar daños en el SNC. Evite también la línea media dorsal, como el corazón larval se encuentra aquí. En esta y las siguientes etapas, utilice siempre la etapa de mover las larvas a la aguja (en lugar de utilizar el manipulador de aguja para mover la aguja). NOTA: El sitio de la inyección específica no importa como RNAi en T. castaneum parece ser sistémica. Sin embargo, es generalmente más fácil de inyectar en el lado dorsal de los segmentos torácicos o abdominales. Después de insertar la aguja en las larvas, saque la aguja ligeramente hacia atrás para dejar espacio para el ARN de doble cadena para entrar en la cavidad del cuerpo de las larvas. Empuje suavemente en la jeringa de inyección hasta que el color verde a su vez las larvas (o el color de la memoria intermedia de inyección) y buscar stretched y lleno. NOTA: Si el aprendizaje de la técnica, tratar de inyectar tanto como sea posible para determinar la cantidad de solución que se puede inyectar en una larva sin letalidad significativa. Es generalmente de aproximadamente 0,5-0,7 l. Retire la aguja de las larvas. Al retirar la aguja, extraiga un poco atrás de la jeringa de inyección para evitar la pérdida de ARN de doble cadena (también tenga cuidado de no tirar en el aire). Inyectar todas las larvas en la diapositiva. Asegúrese de eliminar las larvas que no fueron inyectados con éxito. Inyección completa antes de larvas despertar (en aproximadamente 10 min). Retire la diapositiva con larvas inyectado desde el microscopio de inyección y dejar el portaobjetos durante 5 minutos más hasta que todas las larvas se recupere de la eterización. Con unas pinzas y bajo un microscopio de disección, levante suavemente las larvas de la cabeza a la cola para liberarlos de la diapositiva pegajosa. Coloque las larvas recién publicado en una placa de Petri limpia. Deja las larvas en la placa de Petri durante 10-15 minutos para permitir la inyección wound a coagularse. Colocar las larvas en una nueva botella con harina limpio y apropiadamente etiqueta con el nombre de la cepa, el tipo de dsRNA inyectado, la concentración de dsRNA, número de larvas inyectado, y la fecha. Cultura las larvas inyectado a 30 ° C con 70% de humedad. Observar las larvas de RNAi fenotipos regularmente. NOTA: La última pupate estadio las larvas dentro de los 7 días. Entonces, las pupas se Eclose en adultos después de 7 días (si no hay anormalidad en el momento causado por RNAi). 9. Confirmación de la Rebaja y fenotípicas análisis Considere la posibilidad de evaluar la eficiencia de RNAi tumbar por varias técnicas de biología molecular diferentes, tales como cuantitativa transcripción reversa-PCR (QRT-PCR) y Western Blot. Ver protocolo de Miller et al. 2012 7 y Felipe y Tomoyasu 2011 11 para detallado qPCR y Western Blot, respectivamente. Analizar RNAi fenotipos relacionados. NOTA: RNAi relacionadosfenotipos se pueden observar en diferentes etapas y bajo diferentes condiciones de cultivo, dependiendo de los genes que fueron dirigidos. RNAi puede afectar a la morfología del escarabajo, la metamorfosis, la fisiología y el comportamiento. ¿Con qué frecuencia la presencia de fenotipo se comprueba y bajo qué condiciones los escarabajos se crían deben adaptarse a las preguntas específicas que están siendo investigados por RNAi.