Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle,<em> Tribolium castaneum</em

1 T. Azioni castaneum e coltura Decidere su un T. ceppo castaneum da utilizzare per l'esperimento. NOTA: Diversi T. lab-stabilita ceppi castaneum sono disponibili. Ga-1 (Georgia-1) è il ceppo parentale di Ga-2 che è stato utilizzato per il sequenziamento del genoma 3. Dal Ga-1 parti la maggior parte dei polimorfismi del DNA (come polimorfismi a singolo nucleotide, SNPs) con Ga-2, ed è più sana di Ga-2 a causa di meno consanguineità, è ideale per esperimenti di RNAi. Pu-11 è un altro ceppo comodo da usare , come il suo unico maggiore proteina fluorescente gialla (EYFP) espressione in futuro primordi ala ci permette di distinguere l'ultima instar larve di altri stadi (vedi Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 12). E 'importante documentare che scarabeo ceppo è stato utilizzato nell'esperimento, come sfondi genetici sembrano significativamente AFFect l'RNAi fenotipi 13. Preparare T. castaneum farina cultura con l'aggiunta di 5% (in peso) di lievito di birra pre-setacciato alla farina di grano intero organico (dopo la miscelazione, memorizzare la farina cultura a -20 ° C). Aliquota la farina cultura (a temperatura ambiente) in 6 bottiglie di Drosophila archivi di plastica once (circa 40 g / bottiglia). Cultura T. castaneum a 30 ° C con 70% di umidità. Utilizzare un incubatore umidità controllata, se possibile. Aggiungere 30-40 adulti per bottiglia cultura (rapporto maschi: femmine 1: 1) per avviare la cultura. NOTA: Anche se la muffa è raramente un problema a 30 ° C, temperature più basse (ad esempio 25 ° C) con il 70% di umidità può causare la crescita di muffe nella farina cultura. Abbassare l'umidità se questo si verifica. Trasferire gli adulti ad una nuova cultura bottiglia ogni due settimane per subcoltura (vedere il passaggio 5,2-5,5 per come isolare adulti di farina cultura). NOTA: Ci vogliono circa tre settimane per ottenere l'ultimo larve instar. Alternativavamente, T. culture castaneum possono essere mantenuti ad una temperatura inferiore (20-25 ° C), anche se con un periodo più lungo coltura (tempo di sviluppo a 25 ° C è circa il doppio di quella a 30 ° C). 2. preparazione di soluzioni e strumenti per larvale dsRNA iniezione Sintetizzare molecole di dsRNA omologo al gene bersaglio mediante trascrizione in vitro. Conservare a -80 ° C. Per le procedure di biologia molecolare dettagliate, vedere Filippo e Tomoyasu 2011 11. Si veda anche la discussione di una serie di parametri che devono essere considerati nella progettazione di molecole di dsRNA. Rendere 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C) miscelando 8,5 ml di 1 M Na 2 HPO 4 con 1,5 ml di 1 M NaH 2 PO 4. Controllare il pH con un pHmetro e regolare di conseguenza. Effettuare 1 ml di tampone 10x iniezione miscelando 10 ml di tampone fosfato 0,1 M di sodio (pH 7,6 a 25 ° C), 100 _6, l 0,5 M KCl, 100 ml di colorante alimentare verde, e 790 ml di acqua bidistillata (DDH 2 O). Diluire il buffer 10x iniezione per rendere buffer di iniezione 2x (200 microlitri di buffer 10x iniezione + 800 ml DDH 2 O). Conservare entrambe 10x e 2x iniezione buffer a 4 ° C fino al momento dell'uso. Preparare Slides Vetro Sticky. Coprire un intero vetrino con una forma di colla riposizionabile per preparazioni iniettabili larvali. Per le iniezioni adulti o pupa, fare due sottili strisce di colla lungo i bordi più lunghi della diapositiva. Lasciare asciugare la colla per diversi giorni, che assicura che la colla rimane abbastanza di cattivo gusto per aderire coleotteri alla diapositiva, pur rimanendo abbastanza flessibile per facilitare la loro rimozione dopo l'iniezione. NOTA: Se la colla rimane troppo appiccicoso, utilizzare un dito e toccare la colla, che ridurrà il cattivo gusto. Ogni diapositiva può contenere fino a 40 o 50 coleotteri, e può essere riutilizzata fino a quando non riesce a tenere saldamente gli animali. Alterntivamente, nastro biadesivo può anche essere utilizzato, anche se il nastro adesivo non è talvolta sufficiente per contenere le larve. Fare un eterizzazione Basket. Rimuovere lo stantuffo di una siringa monouso 10 ml, e tagliare la siringa a metà intorno alla linea 6 ml. Eliminare la metà inferiore della siringa. Brevemente riscaldare la superficie di taglio della parte superiore della siringa con un bruciatore a gas, e spingere rapidamente la plastica fusa su un pezzo di maglia di nylon per incollare la maglia sulla siringa. Tagliare via maglie in eccesso una volta che la plastica si indurisce. Preparare la bottiglia di etere. Aggiungere 30 ml di etere in una stretta bocca della bottiglia di vetro 100 o 250 ml. Aggiungere diversi pezzi di carta velina per migliorare l'evaporazione dell'etere. NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Maneggiare sempre l'etere sotto una cappa aspirante. Chiudere il coperchio saldamente quando non in uso. NOTA: ghiaccio può essere utilizzata come alternativa più sicura (ad esempio in classe), anche se il sedation è meno efficace. 3 Preparazione di larvale Apparato di iniezione Inserire un palcoscenico meccanico XY su un microscopio da dissezione. NOTA: XY meccanica sono disponibili presso grandi aziende microscopio. In alternativa, le fasi microscopio economici possono essere utilizzati anche per la maggior parte dei microscopi dissezione con alcune modifiche (vedere la tabella Materiali per esempio). Inserire un ago manipolatore meccanico vicino al palco meccanico XY. Montare una siringa per iniezione. Utilizzare un rubinetto a quattro vie (con attacchi Luer) per collegare una siringa monouso 30 ml di un porta-aghi di vetro, permettendo la manipolazione della siringa senza influenzare la pressione nel ago di iniezione (vedere Filippo e Tomoyasu 2011 11 per la siringa di iniezione dettagliata assemblaggio). 4. Pulling aghi per iniezione Tirare aghi di vetro borosilicato (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm 15 cm di lunghezza) da unestrattore ago. NOTA: Per Sutter P-87 o P-97, utilizzare l'impostazione "Calore = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tempo = 90" o seguire il Capitolo 2 della pipetta Cookbook: cellulari aderenti, C. elegans, Drosophila, e Zebrafish – Programmi consigliati. Le impostazioni ottimali variano a seconda del modello di estrattore ago. L'impostazione per un generico ago per l'iniezione Drosophila è un buon punto di partenza. Conservare tirato aghi in una custodia di plastica (ad esempio, un caso di CD in plastica) e fissare con mastice di montaggio rimovibile. 5 Isolamento e selezione di larve Posizionare un 25 # setaccio su un ricevitore setaccio. Inserire il contenuto del flacone cultura (coleotteri e farina cultura) sul setaccio e setacciare immediatamente il contenuto. Non lasciare il contenuto del setaccio, senza vagliatura, come larve rapidamente cercare di scavare attraverso il setaccio e si blocca. Aggressivamente vagliare i contenuti per far cadere la farinaattraverso e lasciare le larve più anziani (in genere 6 ° e 7 ° instar larve), pupe e adulti (con le loro cuticole del cast-off, esuvie) dietro in cima al setaccio. Trasferire i materiali che rimangono sul setaccio (coleotteri e esuvie) alla padella seme. Toccare ripetutamente la padella per evitare che i coleotteri di fuggire. Rimuovere il esuvie e le particelle di farina rimanenti sulla superficie dei coleotteri soffiando delicatamente sopra la padella seme. Premere il pan seme per spostare il contenuto al fondo della padella. Poi, lasciare il pan inutilizzato per alcuni secondi. Attendere che per gli adulti, che sono più mobili rispetto ad altre fasi, di uscire dal mucchio. Rimuovere adulti utilizzando un pennello arte (es, larghezza 1 cm). Pupe separata battendo delicatamente la padella seme, mantenendo la bocca della padella leggermente verso il basso, come pupe tendono a rotolare velocemente verso la bocca. Utilizzare un pennello per rimuovere le pupe, lasciando solo le larve sul piatto seme. Plasso le larve isolato in un piatto pulito Petri. Selezionare un adeguato livello di larve per l'iniezione e metterli in una capsula di Petri separata. NOTA: All'inizio dello scorso larve instar (1-2 giorni dopo la muta larvale finale) sono spesso adatti quando si analizza l'effetto RNAi su morfologie adulti, così come su metamorfosi. E ', tuttavia, a volte necessario per eseguire RNAi al penultimo (o anche prima) fase per valutare la funzione del gene precoce (ad esempio, figure 3E-3H. Vedere anche Clark-Hachtel et al. 2013 12). Utilizzare pupe come riferimento per identificare il formato di instar larve. L'ultimo larve instar sono leggermente più lungo di pupe. Alternativamente, pu-11 può essere utilizzato per identificare l'ultimo larve instar nonché per determinare l'andamento nel tempo dello sviluppo di larve instar ultimo (Figura S4 di Clark-Hachtel et al. 2013 12). Mantenere le larve selezionato in una capsula di Petri fino eterizzazione. Posizionare il restodi larve e di altri stadi di coleotteri (come pupe e adulti) di nuovo in una bottiglia cultura con farina e restituirlo al incubatore. 6 Preparazione di aghi per iniezione Posizionare un ago di vetro precedentemente tirato su un vetrino da microscopio in vetro utilizzando tack adesivo o nastro biadesivo. Utilizzando pinze, testare la fine tirato dell'ago, mentre guardando attraverso il microscopio da dissezione per vedere dove le curve punta. Afferra l'area leggermente verso il lato punta dove le curve ago con il forcipe e torsione di rompere. Mantenere buoni aghi e scartare gli altri. Si consideri un buon ago come avente un'apertura che non è né troppo grande né troppo piccolo (circa 0,05 mm di diametro. Figure 1A e 1B), ed è angolato per rendere la penetrazione della cuticola larvale facile (Figure 1B e 2A-2B). Si consideri un cattivo ago come (i) troppo piccolo, rendendo l'assorbimento della soluzione di dsRNA nell'ago difficulto (punto 7) (Figure 1D e 2D), (ii) troppo grande, causando lesioni larvale e possibile letalità a seguito di iniezione (figure 1C e 2F), (iii) schietto, rendendo la penetrazione della cuticola difficile e aumentando lesioni. Inserire l'ago nel porta-aghi. In primo luogo, svitare la punta del supporto dell'ago e posizionare l'estremità posteriore dell'ago nella punta titolare. Quindi, posizionare la guarnizione di gomma sotto la punta titolare (almeno 1 cm dall'estremità posteriore del ago di vetro). Inserire la parte posteriore dell'ago nel supporto, con la guarnizione di gomma completamente inserito nell'apertura del supporto dell'ago. Avvitare la punta di nuovo sul supporto. Posizionare il supporto dell'ago montato sul manipolatore ago. Tenere il porta-aghi vicino a orizzontale. Regolare la posizione del manipolatore, in modo che la punta dell'ago si trova nel centro della vista quando si cerca attraverso il microscope. 7 Soluzione prealimentazione dsRNA nel Needle Preparare la soluzione iniettabile dsRNA appena prima dell'iniezione, regolando la concentrazione con DDH 2 O e miscelare la soluzione dsRNA con uguali volumi di tampone di iniezione 2x (punto 2.3). Mantenere la soluzione mista su ghiaccio. Si veda la discussione per quanto riguarda la concentrazione dsRNA. Tagliare la punta di un 20 microlitri punta della pipetta monouso. Pipettare 10 ml della soluzione nella punta della pipetta tagliato. Rimuovere con cautela la punta della pipetta dalla pipetta mantenendo il liquido sulla punta fornendo contropressione. In alternativa, rimuovere con attenzione la punta e quindi spostare la soluzione alla fine della punta fornendo pressione con un dito. Posizionare la punta della pipetta con la soluzione dsRNA sul palco microscopio utilizzando appiccicosa aderenza con l'apertura rivolta verso la punta dell'ago. Guardando attraverso il microscopio, spostare lentamente la punta carica verso l'ago fino a che la punta delago è appena dentro la punta della pipetta caricato e nella soluzione. Guardando attraverso il microscopio, delicatamente tirare indietro lo stantuffo della siringa per estrarre lentamente la soluzione dsRNA nell'ago. NOTA: Non sovraccaricare l'ago. Come la fine della soluzione dsRNA avvicina alla punta dell'ago, rallentare la velocità di trazione e interrompere il caricamento della soluzione prima della punta dell'ago raggiunga aria. Se l'aria raggiunge la punta, la soluzione sarà rapidamente disegnato nel porta-aghi, causando seri problemi di contaminazione. Procedure di pulizia dettagliate dei porta-aghi sono descritte in Filippo e Tomoyasu 2011 11. Togliere la pressione dalla siringa di iniezione e porta-aghi aprendo il rubinetto. Quindi, spostare la punta della pipetta di distanza dalla punta dell'ago. Sollevare l'ago dal palco per evitare di danneggiare accidentalmente l'ago mentre si posiziona il larve sul palco. Rimuovere la punta della pipetta svuotato dal palco. </ol> 8 dsRNA iniezione Posizionare le larve nel cestino eterizzazione. Utilizzare meno di 10 larve se l'apprendimento della tecnica. Utilizzare 30-40 larve in un round, una volta agio con la tecnica. Posizionare il cestello con larve in bottiglia nell'etere e chiudere il coperchio. NOTA: Ether presenta un pericolo di incendio ed è anche dannoso. Eseguire questo passaggio sotto una cappa aspirante. Larve Etherize per circa 3 min. Controllare le larve di movimento dopo 3 min. Metterli nella bottiglia nell'etere per altri 30 secondi se sono ancora in movimento. Non Etherize per più di 5 minuti in quanto ciò può aumentare la mortalità. NOTA: Il momento ottimale eterizzazione può variare a seconda della temperatura e dell'umidità. Trasferire le larve eterizzò dal cestello al bordo antiaderente di un vetrino di vetro appiccicoso. Utilizzando una pinza e guardando attraverso il microscopio, raccogliere ognuno larve per uno e metterli sul vetrino. Lay loro lateralmente e delicatamente toccare i loro corpi ftesta rom a coda con le pinze, un po 'di stretching come si va, per assicurarsi che essi siano fissati sul vetrino. Posizionare il vetrino appiccicosa con larve sul palco microscopio. Inserire l'ago caricato dsRNA dolcemente verso il lato dorsale delle larve per evitare di danneggiare il sistema nervoso centrale. Evitare anche la linea mediana dorsale, come il cuore larvale si trova qui. In questo e in successive fasi, utilizzare sempre la fase di spostare le larve all'ago (invece di utilizzare il manipolatore ago per spostare l'ago). NOTA: Il sito di iniezione specifico non importa come RNAi in T. castaneum sembra essere sistemica. Tuttavia, di solito è più facile da iniettare nel lato dorsale dei segmenti toracici o addominali. Dopo aver inserito l'ago nel larve, estrarre l'ago leggermente indietro per lasciare spazio per il dsRNA per entrare nella cavità del corpo larvale. Premere delicatamente sulla siringa per iniezione fino a che il verde larve turno (o il colore del tampone iniezione) e guardare stretched e pieno. NOTA: Se l'apprendimento della tecnica, cercare di iniettare il più possibile per determinare la quantità di soluzione che può essere iniettato in una larva senza significative letalità. Si tratta generalmente di circa 0,5-0,7 ml. Rimuovere l'ago dalla larve. Durante la rimozione dell'ago, tirare leggermente indietro sulla siringa iniezione per evitare la perdita di dsRNA (essere anche attenzione a non tirare in aria). Iniettare tutte le larve sulla diapositiva. Assicurarsi di rimuovere le larve che non sono stati iniettati con successo. Iniezione completa prima di larve di svegliarsi (in circa 10 min). Rimuovere il vetrino con larve iniettata dal microscopio di iniezione e lasciare la diapositiva per ulteriori 5 minuti fino a che tutte le larve riprendersi dalla eterizzazione. Con una pinza e sotto un microscopio da dissezione, sollevare delicatamente le larve dalla testa alla coda di liberarli dalla diapositiva appiccicoso. Posizionare le larve appena rilasciata in un piatto pulito Petri. Lasciare le larve sulla piastra di Petri per 10-15 minuti per consentire l'iniezione wound di coagulo. Inserite le larve in un nuovo flacone con farina pulito ed etichetta adeguatamente compreso il nome del ceppo, il tipo di dsRNA iniettato, la concentrazione di dsRNA, numero di larve iniettato, e la data. Cultura le larve iniettato a 30 ° C con 70% di umidità. Osservare le larve di RNAi fenotipi regolarmente. NOTA: L'ultima pupate instar larve entro 7 giorni. Poi, le pupe si Eclose in adulti dopo 7 giorni (se non vi è nessuna anomalia nei tempi causata da RNAi). 9 Conferma della Knockdown e fenotipica analisi Considerare valutare l'efficienza di RNAi abbattere da vari differenti tecniche di biologia molecolare, quali quantitativa di trascrizione inversa-PCR (qRT-PCR) e Western Blotting. Vedere Miller et al. 2012 7 e Filippo e Tomoyasu 2011 11 per informazioni dettagliate qPCR e Western Blot protocollo, rispettivamente. Analizzare RNAi fenotipi correlati. NOTA: RNAi correlatefenotipi possono essere osservati in diverse fasi diverse e in diverse condizioni di coltura, a seconda dei geni che erano mirati. RNAi può influenzare il coleottero morfologia, metamorfosi, della fisiologia e del comportamento. Quanto spesso la presenza di fenotipo viene controllato e in quali condizioni i coleotteri sono allevati devono essere adattati alle specifiche domande indagati attraverso RNAi.