Summary

Floresan protein ifadesindeki<em> Branchiostoma lanceolatum</em> Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Abstract

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Introduction

Gelişimi sırasında, tek bir hücre, hücre bölünme ve hareketleri hem de içeren oldukça karmaşık bir işlem olarak, bütün bir organizma neden olur. Iyi hücre davranış dinamiklerini yatan biyolojik prensiplerini anlamak, gelişimsel biyologlar floresan tabanlı vivo görüntüleme teknikleri kullanmaya başlamıştır. Bu tür hücre membranları gibi hücre spesifik bölmeleri, ya floresan boyalar ile muameleler ile spesifiklik eksikliği ve doku penetrasyonu 1 engellenmektedir bir yaklaşım olarak etiketlenmiş olabilir, ya da floresan proteinleri 2 kodlayan eksojen mRNA'ların embriyo özgü sokulmuştur. Farklı teknikler mRNA gibi eksojen bileşikler, etkili bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. Bunlar arasında, ancak mikroenjeksiyon, elektroporasyon, mikro parçacıklar, lipofeksiyon ve transdüksiyon 3,4 ile bombardıman, bunlarla sınırlı değildir. Bu yaklaşımların her bir egzojen bileşikleri sokmak için kullanılabilir, ancakgelişmekte olan embriyo, sadece mikroenjeksiyon, her hücrede 3 içine önceden tanımlanmış ve hassas miktarlarda uygulama sağlar. Mikroenjeksiyon teknikleri tüm önemli gelişim model sistemler için de tarif edilmiştir 4 (örneğin, meyve sinekleri, nematod kurtlar, zebra balığı, kurbağa, fareler) ve gelişim mekanizmalarına evrimini anlamak amacıyla karşılaştırmalı çalışmalar için kullanılanlar dahil olmak üzere, bazı alternatif modeller 4, olduğu gibi (örneğin, deniz lalesi, halkalı solucanlar, deniz kestaneleri, ascidian gömlekliler, Kafatassızlar Amphioxus).

Birlikte gömlekliler ve kordalı filumunu kurmak omurgalılar ile, özellikle çok uygun modeller sefalokordatlar, omurgalılar evrimini ve omurgasız atadan 5-8 arası omurgalıların çeşitlendirilmesi çalışma. Kafatassızlar soyu çok erken kordalı evrimi sırasında ayrılmaktadır; ve üç cins bölünmüştür kaybolmamış sefalokordatlar, (Branchiostoma, Asymmetron ve Epigonichthys), omurgalılar benzer hem genel anatomi ve genom mimarisi 5-8 açısından. Şimdiye kadar tarif edilmiş sefalokordatlar yaklaşık 30 türün, beş embriyolojik ve geliştirme çalışmaları 6,9 için kullanılabilir: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet) Branchiostoma floridae (Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Avrupa Amphioxus), Branchiostoma belcheri (Çin Amphioxus) ve Branchiostoma japonicum (Japon Amphioxus). Bu türlerin üç olgun yetişkin (B lanceolatum, B. belcheri ve B japonicum) isteğe bağlı üreme mevsiminde 10,11 boyunca yumurtlamaya indüklenebilir. Buna ek olarak, en az bir B. lanceolatum verimli yumurtlama böylece ayrıca LABORATOR için bu özel Kafatassızlar türleri erişilebilir hale yapay deniz suyu 12 indüklenebilirDoğal deniz suyuna erişimi olmayan ler. B. kombinasyon, lanceolatum, mikroenjeksiyon gibi etkin bir dağıtım yöntemi ile embriyo için uygun ve güvenli erişim, şimdiye kadar 13-15, (b floridae ve B belcheri hem de) amphioxus içinde gelişmiş sadece uygulama tekniği, geliştirilmesini mümkün kılmaktadır soy tracing- ve dinamik hücre davranış tabanlı yaklaşımları içeren manipülatif teknikler, yeni paketi.

MRNA etkin mikroenjeksiyon için bir protokol B floresan proteinleri ifade etmek için lanceolatum embriyo dolayısıyla geliştirilmiştir. Ayrıca, B. canlı görüntüleme için bir temel araç seti temin etmek lanceolatum embriyolar, vektör sistemleri zara bağlı ve floresan proteinleri nükleer ekspresyon izin veren geliştirilmiştir. Membran hedeflemesi için, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) mCherry ve eGFP insan HRAS CAAX kutusu ve nükleer lokalizasyon oldu erimiş olduzebra balığı histon 2B (H2B) ekson (Şekil 1, ek İçerik 1) füzyon yoluyla elde edilmiştir. Ayrıca, protein dönüşümünü optimize etmek amacı ile, konstruktların Kozak dizilerini ve kodonlar değiştirilmiş ve B kullanılmak üzere uyarlanmış lanceolatum. Birlikte ele alındığında, burada sunulan enjeksiyon yöntemi ve ifade vektörleri özellikle son vivo görüntüleme teknikleri floresan tabanlı kullanarak analizler, sefalokordatlar için yeni deneysel yaklaşımlar üretilmesi için bir temel olarak hizmet verecek.

Protocol

Araçların ve Reaktifler 1. Hazırlık Pasteur pipet aktarın Farklı hızlarda bir alev üzerinde 230 mm uzunluğunda Pasteur pipetler çekerek, farklı uç çapları transfer Pasteur pipetler bir dizi oluşturun. Konik aspirasyon düzgün ve ince kontrolü için mümkün olduğunca uzun olduğundan emin olun. Bir elmas çizici ile, dik pipet uzunluğu bir hat boyunca pipet çizmeyin. Her iki elinizle, künt kesim oluşturmak için kendi uzunluğuna pipet parale…

Representative Results

Yukarıda ayrıntılı protokol B mikroenjeksiyonu için temel sağlar lanceolatum oositler ve dolayısıyla B geliştirilmesi dahil edilmek için mRNA lanceolatum embriyolar in vivo görüntüleme için floresan proteinleri kodlayan. Tekniği kesinlikle sağlam ve güvenilir olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak başarılı enjeksiyonları oranı değişken (Tablo 1) kalır. Bu ilginç aslında çok olası bir açıklama oosit kavramaları aşırı de?…

Discussion

Bu makalede, B. enjeksiyonu için, ilk kez için, ayrıntılı ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcut lanceolatum oositleri, burada, daha sonra B floridae 13,14 ve B belcheri 15, bu nedenle bu tür bir teknik tarif edilmiş olan üçüncü Amphioxus türdür. Önemli olarak, iletişim kuralı, aynı zamanda B floresan protein üretimi için uygun vektör sistemlerinin açıklamasını içerir Burada açıklanan in vitro koşullarda üretil…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar hayvancılık için "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" tarafından destek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programı hibe "Embryomics" tarafından ve ANR hibe "tarafından, Michael Schubert ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 ve ANR-11-JSV2-002-01) fonları tarafından desteklenen ANR- Jean-François Nicolas ve Nadine Peyriéras 10-BLAN-121.801 Dev-Süreci ". João Emanuel Carvalho bir FCT doktora bursu ile finanse edilmektedir (SFRH / BD / 86878/2012).

Burada anlatılan vektörler talepleri yazarlara doğrudan ele alınabilir.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Consumables
35 mm Petri dishes Falcon 353001 culture-treated
Filtration unit (Stericup 1L) Fisher W21719 0.22 micron filtration
Spin-X tubes Costar 8160 0.22 micron filtration tube
Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries WPI E212
Pasteur Pipettes 230 mm long
Aspiration tube Dutscher 75056
Capillaries for injection needles Sutter BF 120-94-10 Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm
Reagents
Low-melting agarose SIGMA A9414
Phenol Red SIGMA 114537
Glycerol SIGMA G2025
Poly-L-Lysine hydrobromide SIGMA P9155
H2O Dnase, Rnase-free Gibco 10977-035
mMessage mMachine SP6 Transcription kit Ambion AM1340 mRNA synthesis kit
Phenol pH8 SIGMA P4557
24:1 chloroform:isoamylic alcohol SIGMA C0549
5:1 phenol pH4.7:chloroform SIGMA P1944
Reef Crystal salts (200 kg) Europrix  Commercial salts
Equipment
Fluorescent dissecting scope with 200x magnification  Leica MZ16F 25x oculars, DSR and GFP2 filters
Micromanipulator Marzhauzer M-33
Injector Picospritzer model II or III
Needle puller Sutter P97 heating-filament needle puller
Fine forceps FINE SCIENCE TOOLS GMBH 11252-30 Dumont #5

References

  1. Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
  3. Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
  4. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
  5. Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
  6. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  7. Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
  8. Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
  9. Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  10. Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
  11. Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
  12. Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
  13. Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
  14. Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
  15. Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
  16. Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
  17. Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
  18. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
  21. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
  22. Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
  23. Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
  24. Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
  25. Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
  26. Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
  27. Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
  28. Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
  29. Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
  30. Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
  31. Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
  32. Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).

Play Video

Cite This Article
Hirsinger, E., Carvalho, J. E., Chevalier, C., Lutfalla, G., Nicolas, J., Peyriéras, N., Schubert, M. Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes. J. Vis. Exp. (95), e52042, doi:10.3791/52042 (2015).

View Video