Expresión de proteínas fluorescentes en<em> Lanceolatum Branchiostoma</em> Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados
Summary
Presentamos aquí la expresión robusta y eficiente de proteínas fluorescentes después de la inyección de ARNm en oocitos no fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. El desarrollo de la técnica de microinyección en este cordado basal allanará el camino para que alcance las innovaciones técnicas en este sistema modelo emergente, incluyendo imágenes in vivo y manipulaciones de genes específicos.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Durante el desarrollo, una sola célula da lugar a un organismo entero en un proceso altamente complejo que implica tanto las divisiones celulares y movimientos. Para entender mejor los principios biológicos que subyacen a la dinámica del comportamiento celular, los biólogos del desarrollo han comenzado a utilizar en las técnicas de imagen in vivo basado en la fluorescencia. Compartimentos específicos de células, tales como las membranas celulares, o bien pueden ser etiquetados por los tratamientos con colorantes fluorescentes, un enfoque obstaculizado por la falta de especificidad y de penetración en el tejido 1, o por la introducción específica en el embrión de mRNAs exógenos que codifican proteínas fluorescentes 2. Diferentes técnicas pueden ser utilizadas para la prestación eficiente de compuestos exógenos, tales como mRNAs. Estos incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, bombardeo con micropartículas, lipofección y la transducción de 3,4. Aunque todos estos enfoques se puede utilizar para introducir compuestos exógeno en unaembrión en desarrollo, sólo microinyección permite la aplicación de cantidades predefinidas y precisas en cada celda 3. Las técnicas de microinyección se han descrito para los principales sistemas modelo de desarrollo 4 (por ejemplo, moscas de la fruta, gusanos nematodos, pez cebra, ranas, ratones), así como para algunos modelos alternativos 4, incluyendo los utilizados para los estudios comparativos destinados a comprender la evolución de los mecanismos de desarrollo (por ejemplo, las anémonas de mar, gusanos anélidos, erizos de mar, tunicados ascidia, la amphioxus cephalochordate).
Cephalochordates, que junto con los tunicados y los vertebrados establecen filo cordados, particularmente modelos muy adecuado para estudiar la evolución de los cordados y la diversificación de los vertebrados de un antepasado de invertebrados 5-8. El linaje cephalochordate divergieron muy temprano durante la evolución cordado; y cephalochordates existentes, que se subdividen en tres géneros (Branchiostoma, Asymmetron y Epigonichthys), se asemejan a los vertebrados, tanto en términos de anatomía general y la arquitectura del genoma 5-8. De los aproximadamente 30 especies de cephalochordates que se han descrito hasta el momento, cinco son disponibles para los estudios y de desarrollo embriológico 6,9: Asymmetron lucayanum (la lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (la amphioxus Florida), Branchiostoma lanceolatum (la amphioxus Europea), Branchiostoma belcheri (el anfioxo chino) y Branchiostoma japonicum (el anfioxo japonés). Adultos maduros de tres de estas especies (B. lanceolatum, B. belcheri y B. japonicum) pueden ser inducidas a desovar en la demanda durante la temporada de cría 10,11. Además, al menos por B. lanceolatum, el desove eficiente también puede ser inducida en agua de mar artificial 12, con lo que esta especie cephalochordate particulares accesible para laborators que no tienen acceso a agua de mar natural. La combinación, en B. lanceolatum, de un acceso conveniente y confiable para los embriones con un método de entrega eficiente, tales como la microinyección, hasta ahora la única técnica de administración desarrollada en anfioxo (tanto en B. floridae y B. belcheri) 13-15, permitirá el desarrollo de un novela conjunto de técnicas de manipulación, incluyendo tracing- linaje y los enfoques basados en el comportamiento de células dinámico.
Un protocolo para la microinyección eficiente de mRNAs para expresar proteínas fluorescentes en la B. lanceolatum embrión se desarrolla, por lo tanto. Además, para proporcionar un conjunto de herramientas básica para imágenes en vivo de B. embriones lanceolatum, sistemas de vectores se desarrollaron que permiten asociada a la membrana y la expresión nuclear de proteínas fluorescentes. Para la orientación de la membrana, el aumento de la proteína verde fluorescente (EGFP) se fusionó a la caja CAAX HRAS humano y la localización nuclear de mCherry y EGFP seobtenido por fusión a la exón 2B histona pez cebra (H2B) (Figura 1, Archivo 1). Además, con el objetivo de optimizar la traducción de proteínas, las secuencias Kozak y los codones de las construcciones se han modificado y adaptado para el uso en B. lanceolatum. Tomados en conjunto, los vectores de método y de expresión inyección presentados aquí servirán como base para la generación de nuevos enfoques experimentales para cephalochordates, los análisis en particular utilizando la última fluorescencia basada en técnicas de imagen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, presentamos, por primera vez, un protocolo detallado y reproducible para la inyección de B. ovocitos lanceolatum, que, después de B. floridae 13,14 y B. belcheri 15, es, pues, la tercera especie amphioxus, para los que tal técnica se ha descrito. Es importante destacar que el protocolo descrito aquí también incluye la descripción de sistemas de vectores adecuados para la producción de proteínas fluorescentes en B. lanceolatum a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo por el "Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette" para la cría de animales. Este trabajo fue apoyado por fondos de la ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 y ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, por la subvención de la Unión Europea 6PM "Embryomics" y por la subvención ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Proceso "de Jean-François Nicolas y Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho es financiado por una beca de doctorado FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Las solicitudes de los vectores descritos aquí pueden dirigirse directamente a los autores.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
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