ביטוי של חלבונים ניאון ב<em> Lanceolatum מיתרני הראש</em> על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה
Summary
אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
במהלך פיתוח, תא בודד מוליד כל אורגניזם בתהליך מורכב ביותר שיש בו שני חלוקות תא ותנועות. כדי להבין טוב יותר את העקרונות הביולוגיים העומדים בבסיס הדינמיקה של התנהגות תא, ביולוגים התפתחותיים החלו להשתמש בטכניקות ההדמיה vivo הקרינה מבוססת. תאים מסוימים של תאים, כגון קרום תא, יכולים גם להיות שכותרתו על ידי טיפולים עם צבעי ניאון, גישה הקשתה על ידי חוסר הייחוד ושל חדירת רקמת 1, או על ידי ההקדמה הספציפית לעובר של mRNAs אקסוגניים קידוד חלבוני ניאון 2. טכניקות שונות יכולות לשמש לאספקה היעילה של תרכובות חיצוניות, כגון mRNAs. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל, microinjection, electroporation, הפצצה עם microparticles, lipofection ותמרת 3,4. למרות שכל הגישות הללו יכולים לשמש כדי להציג את התרכובות אקסוגניים לפיתוח עובר, רק microinjection מאפשר היישום של כמויות מוגדרות מראש ומדויקות לכל תא 3. טכניקות Microinjection תוארו עבור כל מערכות המודל ההתפתחותי הגדולות 4 (לדוגמא, זבובי פירות, נמטודות, דג הזברה, צפרדעים, עכברים), כמו גם לכמה מודלים חלופיים 4, כוללים אלה המשמשים למחקרים השוואתיים שמטרתו להבין את האבולוציה של מנגנוני התפתחות (למשל, שושנות ים, תולעי תולעים טבעתיים, קיפודי ים, tunicates ascidian, amphioxus מיתרני הראש).
Cephalochordates, אשר יחד עם tunicates ובעלי חוליות להקים מַעֲרָכָה chordate, במיוחד דגמים מתאימים היטב לחקר האבולוציה של chordates והגיוון של בעלי חוליות מאב קדמון חסר חוליות 5-8. שושלת מיתרני הראש התפצלה בשלב מוקדם מאוד במהלך האבולוציה chordate; וcephalochordates הקיים, אשר מחולקים לשלושה genera (Branchiostoma, Asymmetron וEpigonichthys), דומה לבעלי חוליות הן מבחינת האנטומיה כוללת ואדריכלות הגנום 5-8. של המינים על 30 של cephalochordates שתוארו עד כה, חמש זמינים למחקרים עובריים והתפתחותיים 6,9: lucayanum Asymmetron (אִזְמֵלוֹן בהאמה), מיתרני ראש הדגלונים (amphioxus פלורידה), lanceolatum מיתרני הראש (amphioxus האירופי), מיתרני הראש belcheri (amphioxus הסיני) ומיתרני הראש ג'אפוניכאם (amphioxus היפני). מבוגרים הבשלים של שלושה ממינים אלו (lanceolatum ב ', ב' ו- B. belcheri ג'אפוניכאם) יכולים להיגרם ללהשריץ על פי דרישה בעונת הרבייה 10,11. בנוסף, לפחות עבור B. lanceolatum, השרצה יעילה יכולה גם להיגרם במי ים מלאכותיים 12, ובכך הופכת את מיני מיתרני ראש מסוימים הזה נגיש לLaboratories שאין להם גישה למי ים טבעי. שילוב, בB. lanceolatum, של גישה נוחה ואמינה לעוברים עם שיטת אספקה יעילה, כגון microinjection, עד כה טכניקת המשלוח בלבד שפותחה בamphioxus (בשני B. דגלונים וB. belcheri) 13-15, תאפשר הפיתוח של חבילת רומן של טכניקות מניפולטיביות, כולל tracing- שושלת וגישות המבוססת על התנהגות תא דינמי.
פרוטוקול לmicroinjection יעיל של mRNAs לבטא חלבוני ניאון בB. עובר lanceolatum פותח ומכאן. יתר על כן, כדי לספק ערכת כלים בסיסיות להדמית חיה של B. עוברי lanceolatum, מערכות וקטור פותחו המאפשרות קרום הקשורים וביטוי גרעיני של חלבוני ניאון. למיקוד קרום, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP) התמזג לתיבה האנושית HRAS CAAX ולוקליזציה גרעינית של mCherry וeGFP היהמתקבל על ידי היתוך לאקסון 2B היסטון דג הזברה (H2B) (איור 1, קובץ משלים 1). יתר על כן, במטרה לייעל את תרגום חלבון, הרצפים וקודונים קוזאק של המבנים שונו והותאמו לשימוש בB. lanceolatum. יחדיו, וקטורי שיטת ההזרקה וביטוי שהוצגו כאן ישמשו כבסיס לדור של גישות ניסיוניות החדשות לcephalochordates, בעיקר ניתוחים באמצעות מבוססת הקרינה האחרונה בטכניקות ההדמיה vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים, בפעם הראשונה, פרוטוקול מפורט ושחזור להזרקה של B. ביציות lanceolatum, אשר, לאחר B. הדגלונים 13,14 ו- B. 15 belcheri, לכן מיני amphioxus שלישיים, שלטכניקה כזו שתוארה. חשוב לציין, הפרוטוקול מתואר כאן כולל גם את התיאור של מערכות וקטור המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר את התמיכה על ידי "Animalerie Centrale de Gif-sur-איווט" לגידול בעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מANR (ANR-09-BLAN-0262-02 וANR-11-JSV2-002-01) למייקל שוברט, על ידי המענק של האיחוד האירופי FP6 "Embryomics" ועל ידי מענק ANR "ANR- 10-BLAN-121,801 Dev-תהליך "לז'אן-פרנסואה ניקולא ונדין Peyriéras. João עמנואל Carvalho ממומן על ידי מענק דוקטורט FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
בקשות לווקטורים שתוארו כאן ניתן לפנות ישירות למחברים.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
