التعبير عن البروتينات الفلورية في<em> السهيم</em> من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في
Summary
نحن التقرير هنا التعبير القوي والفعال للالبروتينات الفلورية بعد حقن مرنا في البويضات غير المخصبة من السهيم. فإن تطوير تقنية حقن مكروي في هذا حبلي القاعدية يمهد الطريق لبعيدة المدى الابتكارات التقنية في هذا النظام النموذجي الناشئة، بما في ذلك في مجال التصوير فيفو والتلاعب الجينات المحددة.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
خلال التنمية، خلية واحدة يثير كائن حي كامل في عملية معقدة للغاية التي تنطوي على كل من الانقسامات والحركات الخلية. من أجل فهم أفضل للمبادئ البيولوجية الكامنة وراء ديناميات سلوك الخلية، والتي علماء البيولوجيا التطورية، لاستخدامها في تقنيات التصوير المجراة على أساس مضان. مقصورات محددة من الخلايا، مثل أغشية الخلايا، يمكن أن تكون إما وصفت من قبل العلاج مع الأصباغ الفلورية، وهو نهج يعوقها عدم وجود خصوصية واختراق الأنسجة 1، أو من خلال إدخال محدد في جنين من mRNAs الخارجية ترميز البروتينات الفلورية 2. تقنيات مختلفة يمكن استخدامها لإيصال الفعال للمركبات خارجية، مثل من mRNAs. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، حقن مكروي، Electroporation للوالقصف مع المجهرية الدقيقة، lipofection والتنبيغ 3،4. على الرغم من كل هذه الأساليب يمكن أن تستخدم لإدخال مركبات خارجية إلىوضع الجنين، حقن مكروي فقط يسمح تطبيق كميات محددة سلفا ودقيقة في كل خلية 3. وقد وصفت تقنيات Microinjection لجميع أنظمة النموذج التنموي الكبرى 4 (على سبيل المثال، ذباب الفاكهة والديدان الخيطية، الزرد، والضفادع، والفئران)، وكذلك لبعض نماذج بديلة 4، بما في ذلك تلك المستخدمة في الدراسات المقارنة التي تهدف إلى فهم تطور آليات التنموية (على سبيل المثال، شقائق البحر والديدان الحلقيات قنافذ البحر، الزقيات ascidian، والحسيكة رأس حبليات).
Cephalochordates، الذي جنبا إلى جنب مع الزقيات والفقاريات إنشاء بعائلة حبلي، بشكل خاص نماذج مناسبة تماما لدراسة تطور الحبليات وتنويع الفقاريات من سلف اللافقاريات 5-8. نسب رأس حبليات تباينت في وقت مبكر جدا أثناء التطور حبلي. وcephalochordates موجودة، والتي تنقسم إلى ثلاثة أجناس (النخالةchiostoma، Asymmetron وEpigonichthys)، تشبه الفقاريات سواء من حيث التشريح العام والهندسة المعمارية الجينوم 5-8. من حوالي 30 نوعا من cephalochordates التي تم وصفها حتى الآن، خمسة المتاحة للدراسات الجنينى والتنموية 6،9: Asymmetron lucayanum (والرميح حيوان باهاما)، الحسيكة floridae (والحسيكة فلوريدا)، السهيم (والحسيكة الأوروبية)، الحسيكة belcheri (والحسيكة الصينية) والحسيكة البلهارسيات اليابانية (للالحسيكة اليابانية). الكبار قد حان لثلاثة من هذه الأنواع (B. السنانية، B. belcheri وB. البلهارسيات اليابانية) يمكن أن يتسبب لتفرخ على الطلب خلال موسم التكاثر 10،11. وبالإضافة إلى ذلك، على الأقل بالنسبة B. السنانية، وضع البيض كفاءة ويمكن أيضا أن يتسبب في مياه البحر الاصطناعي 12، مما يجعل هذا النوع رأس حبليات معينة يمكن الوصول إليها عن المختبرالمنشأ التي ليس لديها إمكانية الوصول إلى مياه البحر الطبيعي. الجمع، في B. السنانية، لسهولة الوصول وموثوق بها إلى الأجنة مع طريقة التسليم كفاءة، مثل حقن مكروي، حتى الآن هذه التقنية تسليم الوحيدة المتقدمة في الحسيكة (في كل B. floridae وB. belcheri) 13-15، سيمكن من تطوير جناح رواية تقنيات التلاعب، بما في ذلك tracing- النسب والنهج القائم على سلوك الخلية الحيوية.
بروتوكول للحقن مكروي كفاءة من mRNAs للتعبير عن البروتينات الفلورية في B. وبالتالي وضعت السنانية الجنين. وعلاوة على ذلك، لتوفير مجموعة أدوات أساسية للتصوير حي لB. الأجنة السنانية، تم تطوير أنظمة النواقل التي تسمح المرتبط الغشاء والتعبير النووي من البروتينات الفلورية. لاستهداف الغشاء، وتنصهر تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) إلى HRAS مربع CAAX البشري وتوطين النووية من mCherry وEGFP كانالتي حصلت عليها الانصهار إلى الزرد هيستون 2B (H2B) اكسون (الشكل 1، الملف التكميلي 1). وعلاوة على ذلك، وذلك بهدف تحسين الترجمة البروتين، تم تعديل تسلسل كوزاك وكودونات من يبني وتكييفها مع الاستخدام في B. السنانية. أخذت معا، فإن طريقة الحقن والتعبير ناقلات المقدمة هنا بمثابة الأساس لجيل من النهج التجريبية الجديدة للcephalochordates، ولا سيما التحليلات باستخدام المستندة إلى مضان أحدث تقنيات التصوير في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، نقدم، لأول مرة، بروتوكول مفصلة وقابلة للتكرار لحقن B. البويضات السنانية، والتي، بعد B. floridae 13،14 وB. belcheri 15، وبالتالي الأنواع الحسيكة الثالثة، والتي وصفت هذه التقنية. الأهم من ذلك، وصف بروتوكول هنا يشمل أيضا وصفا للأنظمة ن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه بالدعم من قبل "Animalerie المركزية دي الصورة المتحركة سور ايفيت" لتربية الحيوانات. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من ANR (ANR-09-بلان-0262-02 وANR-11-JSV2-002-01) لمايكل شوبرت، من خلال منحة الاتحاد الأوروبي FP6 "Embryomics" ومنحة ANR "ANR- 10-بلان-121801 ديف عملية "لجان فرانسوا نيكولا ونادين Peyriéras. ويتم تمويل جواو ايمانويل كارفاليو من قبل زمالة الدكتوراه FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
طلبات ناقلات الموصوفة هنا يمكن معالجتها مباشرة إلى المؤلفين.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
