Trasfezione altamente efficiente di umani THP-1 da macrofagi Nucleofection
Summary
Questo protocollo rappresenta un metodo efficiente e affidabile per transfettare umani THP-1 macrofagi con siRNA o il DNA plasmidico mediante elettroporazione con alta efficienza di trasfezione, pur mantenendo alta la vitalità delle cellule e la piena capacità dei macrofagi per la differenziazione e la polarizzazione.
Abstract
I macrofagi, come i giocatori chiave della risposta immunitaria innata, sono al centro della ricerca che fare con l'omeostasi tissutale o varie patologie. Trasfezione con siRNA e il DNA plasmidico è uno strumento efficace per studiare la loro funzione, ma trasfezione di macrofagi non è cosa da poco. Anche se molti approcci diversi per la trasfezione di cellule eucariotiche sono disponibili, solo alcuni permettono trasfezione affidabile ed efficiente dei macrofagi, ma ridotto la vitalità delle cellule e il comportamento delle cellule gravemente alterato come capacità diminuita di differenziazione o polarizzazione sono frequentemente osservati. Pertanto un protocollo di trasfezione è necessario che sia in grado di trasferire siRNA e DNA plasmidico in macrofagi senza causare gravi effetti collaterali permettendo così l'indagine dell'effetto del siRNA o plasmide nel contesto del comportamento delle cellule normali. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo affidabile ed efficiente per la trasfezione umani THP-1 macrofagi e monocytes con la vitalità delle cellule elevata, ad alta efficienza di trasfezione, e effetti minimi sul comportamento delle cellule. Questo approccio si basa sulla Nucleofection e il protocollo è stato ottimizzato per mantenere la massima capacità di attivazione delle cellule dopo la trasfezione. Il protocollo è adeguata per cellule aderenti dopo distacco così come le cellule in sospensione, e può essere utilizzato per piccole e medie numeri di esempio. Pertanto, il metodo presentato è utile per studiare gene effetti regolatori durante il differenziamento macrofagi e polarizzazione. Oltre a presentare i risultati che caratterizzano macrofagi trasfettate in base a questo protocollo rispetto ad un metodo chimico alternativo, l'impatto della coltura cellulare selezione medio dopo la trasfezione sul comportamento delle cellule è anche discusso. I dati presentati indicano l'importanza di convalidare la selezione di diverse impostazioni sperimentali.
Introduction
Tra le componenti cellulari del sistema immunitario umano, i macrofagi sono di grande importanza per la risposta immunitaria innata. I loro compiti sono diversi; sono coinvolti nella fagocitosi dei patogeni e materiale necrotico, essi svolgono un ruolo importante nella omeostasi tissutale e producono e secernono un gran numero di citochine per regolare e orchestrare la risposta immunitaria 1. Pertanto, i macrofagi sono integralmente coinvolti in molti processi fisiologici e condizioni fisiopatologiche. A causa della diversità dei loro compiti, i macrofagi sono un tipo di cellule molto eterogeneo e multiforme. Ciò si ottiene diverse polarizzazioni; seconda macrofagi stimoli esterni può svilupparsi in differenti fenotipi 2. Variabilità macrofagi 'e impatto sulla risposta immunitaria loro un tema di ricerca molto interessante fanno. Al fine di chiarire la complessa metaboliche e funzioni di regolamentazione, del caso dei macrofagi in vitro sono required che riflettono correttamente macrofagi eterogeneità e variabilità.
Trasfezione di cellule con vettori plasmide di DNA o di piccoli RNA interferenti (siRNA), al fine di alterare l'espressione genica cellulare è diventato uno strumento ampiamente utilizzato e potente in biologia cellulare per lo studio sia per regolazione genica e la funzione del gene. Attualmente c'è una grande selezione di diversi strumenti disponibili per la trasfezione di cellule eucariotiche. Questi strumenti includono l'applicazione di vettori virali, metodi meccanici (come pistole geniche), approcci chimici (che si basano su polimeri o lipidi che possono formare complessi con gli acidi nucleici), ed elettroporazione di cellule 3. Tutti questi approcci hanno i loro vantaggi e svantaggi e scegliendo il più adatto da questa vasta gamma per un tipo di cellula specifico e l'applicazione può essere un processo che richiede difficile e richiede tempo.
I macrofagi sono notoriamente difficili da transfettare transfe come quasi tutti ben consolidataapprocci ction riducono drasticamente la redditività macrofagi o interferire con il loro comportamento, cioè la differenziazione e in particolare polarizzazione. Pertanto, vi presentiamo qui un protocollo efficiente, non virale per trasfettare umani THP-1 macrofagi che utilizzano la tecnologia basata Nucleofector elettroporazione-, che rappresenta un approccio ottimizzato elettroporazione richiedono ridotte quantità di DNA. Nucleofection è particolarmente adatto per le cellule sensibili come monociti e macrofagi. Questo protocollo è un adattamento di versioni precedentemente pubblicati 4,5.
In breve, forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) è usato per differenziare umani THP-1 monociti per 48 ore in macrofagi prematuri prima della trasfezione con siRNA o DNA plasmidico. Per la trasfezione i macrofagi predifferentiated sono staccati enzimaticamente dal trattamento Accutase I. La trasfezione viene eseguita utilizzando un dispositivo 2b Nucleofector per elettroporazione delle cellule. Dopo la trasfezione, differireziazione è continuato per un altro 24 a 48 ore, come richiesto. Infine, macrofagi maturi trasfettate vengono incubate con differenti tipi di mescole per studi funzionali.
Questo approccio consente la trasfezione di linee cellulari come umani THP-1 monociti e macrofagi ed è stato applicato con successo in passato 6-10. Contrariamente alla maggior parte degli approcci di trasfezione chimica, la nostra procedura Nucleofection modificata utilizzando macrofagi prematuri produce alte efficienze di trasfezione in combinazione con la vitalità cellulare intatta, senza la necessità di utilizzare vettori virali o aggiungere ulteriori composti vettore con effetti collaterali sconosciuti. Inoltre, i macrofagi mantengono la loro piena potenzialità di differenziazione e polarizzazione consentendo indagini funzionali senza ostacoli seguente trasfezione 11.
Inoltre, il mezzo di coltura cellulare applicare dopo Nucleofection influenza fortemente studi funzionali seguente transfection; in particolare, la capacità dei macrofagi di polarizzazione può essere influenzato a seconda del mezzo di coltura applicato. Qui quattro diversi tipi di mezzi di coltura cellulare (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 e mouse T cellulare Nucleofector medio) sono stati testati in condizioni di disattivazione utilizzando interleuchina (IL) 10 Uso THP-1 macrofagi, abbiamo osservato che la risposta delle cellule a IL10 è forte quando il mouse T cellulare Nucleofector terreno è usato in confronto agli altri mezzi di coltura di cui sopra. Questi risultati dimostrano che appropriata ottimizzazione di tutte le condizioni di coltura cellulare è fondamentale per il successo di transfezione und successivi studi funzionali come questi possono migliorare significativamente i risultati sperimentali.
Come macrofagi sono coinvolti in varie malattie umane, gran parte della ricerca si concentra su chiarire comportamento macrofagi nonché meccanismi regolativi che influenzano macrofagi o, a sua volta controllata da parte dei macrofagi. Pertanto, questo protocollo è rilevante inmolte aree di ricerca diverse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui presenta un modo affidabile ed efficiente per trasfettare THP-1 macrofagi che di solito sono piuttosto difficili da trasfezione. La trasfezione può essere realizzato con efficienze di trasfezione di sopra del 90% per siRNA senza significativa riduzione della vitalità cellulare. Incrementi di efficienza per plasmidi possono essere meno a causa delle loro dimensioni, ma di trasfezione efficienze di circa il 70% può essere di solito raggiunti. L'efficienza del knockdown siRNA-mediata può raggiungere 80 e il 90% a seconda del siRNA applicata. Un importante vantaggio di questo protocollo è che non interferisce con la differenziazione cellulare. Dopo la trasfezione le cellule ancora rispondono normalmente all'agente differenziazione PMA (Figura 1A 1B e Figura 4) 12. Oltre polarizzazione cellulare da stimoli di citochine quali IL10 o LPS / IFNγ è influenzato 12, anche se questo dipende anche fortemente sul supporto selezionato per la coltivazione dopo trasfezione uns mostrato in Figura 4.
Ci sono diverse opzioni all'interno della procedura che può essere modificata al fine di adattare il protocollo delle specifiche esigenze. Come mostrato in figura 4 le cellule reagiscono diversamente allo stesso stimolo IL10 seconda del mezzo di coltura selezionata dopo la trasfezione. Ciò indica che la composizione media ha una forte influenza sul comportamento cellulare. Dato che l'effetto imposto dal mezzo potrebbe differire per vari stimoli sperimentali, è possibile che il mezzo ottimale potrebbe cambiare e quindi vi è la necessità di verificare l'idoneità del mezzo di differenti esperimenti indipendente. Tuttavia il mezzo RPMI-1640, che è il mezzo predefinito utilizzato per la coltivazione di cellule THP-1, ha dimostrato di essere poco adatto per la coltivazione dopo trasfezione come è stata osservata una significativa perdita di vitalità cellulare. Inoltre, il protocollo può essere applicato anche ad THP-1 monociti senza previa differenziazione PMA-indotta questa,ovviamente, elimina la necessità di distacco delle cellule durante la procedura, ma tutti i passaggi rimanenti non devono essere regolati. I monociti THP-1 possono essere differenziati in seguito, se necessario.
Gli elementi più critici del protocollo sono in primo luogo il distacco e in secondo luogo il tempo richiesto per la trasfezione. Il distacco deve essere eseguito il più delicatamente possibile, al fine di mantenere alta la vitalità cellulare. Vi consigliamo quindi il distacco enzimatico relativamente mite da Accutase I over metodi molto aggressivi come tripsinizzazione. Altri metodi di distacco come il trattamento con Lidocaina o raschiatura sono risultati piuttosto dannosa e non devono essere utilizzati. Nel caso in cui 30 minuti di trattamento Accutase non dovrebbe essere sufficiente a staccare tutte le cellule correttamente questo è di solito un'indicazione di soluzione Accutase ho erroneamente conservati o scaduti o di un numero eccessivo di cicli di congelamento-scongelamento. Abbiamo ottenuto buoni risultati per la memorizzazione di piccole aliquote di Accutase io a -20 °C per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Tuttavia, quando vi è il distacco sufficiente sostituire Accutase I con Accutase freschi o aumentare il tempo di incubazione fino a 1 ora. Inoltre picchiettando leggermente o risciacquo del pallone o piastra può aiutare il distacco. Per quanto riguarda il tempo necessario per la trasfezione il tempo di esposizione delle cellule alla soluzione pura Nucleofector ha elevato impatto sulla sopravvivenza cellulare e quindi dovrebbe essere il più breve possibile. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è quello di eseguire ogni trasfezione alla volta (passi 2,10-2,15) e non più transfezioni in parallelo.
Se l'efficienza knockdown è bassa, questo di solito non è causato dalla bassa efficienza di trasfezione, ma questo può essere facilmente verificata mediante citometria a flusso o microscopia a fluorescenza e fluorescente siRNA o un plasmide codifica GFP. Per lo più la causa è un siRNA o il DNA plasmide inefficiente. In queste circostanze dovrebbe essere considerata per aumentare la quantità di siRNA (fino a 2-3 mg) oDNA plasmidico (fino a 1-2 mg) o per utilizzare un diverso siRNA o vettore di espressione, se disponibile. In alternativa, risultati soddisfacenti possono essere ottenuti anche mediante un pool di diversi siRNA differenti diretti contro lo stesso bersaglio. Inoltre, gli esperimenti del corso di tempo potrebbe essere richiesto di determinare con precisione il periodo di massimo effetto, che di solito raggiunge dopo 24-72 ore dopo la trasfezione.
Oltre trasfezione mediante elettroporazione ci sono ulteriori tecniche ben consolidate per la trasfezione di cellule di mammifero. Frequentemente sistemi applicati sono agenti di transfezione chimici che possono formare complessi con l'acido nucleico di carico e quindi facilitare il trasporto nelle cellule. I reagenti più comunemente utilizzati si basano sia su diverse specie di lipidi o possono essere scelti da un certo numero di polimeri cationici 3. Per entrambi gli approcci una diversa selezione è disponibile in commercio. Questi reagenti di trasfezione offrono il vantaggio di essere generalmentefacile da usare, non richiedono molto tempo, e lavorare con cellule aderenti pure, eliminando così la necessità di distacco. Purtroppo, i macrofagi sono piuttosto difficili da trasfettare da questi metodi in quanto non proliferano in modo significativo in vitro e possiedono meccanismi di difesa contro il DNA estraneo citosolico 13-15. Così, gli approcci di transfezione chimici spesso si traducono in una grave riduzione della vitalità cellulare. Tuttavia come mostrato in Figura 2 vi sono agenti di transfezione chimici in grado di trasferire con successo siRNA in macrofagi, ma come citofluorimetrica (Figura 2A) e microscopica fluorescente (Figura 2B) analisi indicano che non riescono a raggiungere la stessa distribuzione omogenea dei siRNA all'interno delle cellule come ottenuto da Nucleofection. Infatti, i dati di citometria a flusso indicano che due differenti popolazioni di cellule trasfettate verificano, innanzitutto una popolazione con fluorescenza simile come le cellule dopo Nucleofectisul rilevamento e in secondo luogo vi è una popolazione con più intensa fluorescenza. Conferma definitiva è ancora necessaria, ma supponiamo che la prima popolazione è in microscopia a fluorescenza identici a quelle cellule che mostrano una distribuzione omogenea dei siRNA fluorescente all'interno del citoplasma, mentre la seconda popolazione che rischia corrisponde alle cellule con agglomerati molto luminosi. I dati di citometria a flusso illustrati nella Figura 2A suggeriscono che i risultati nucleofection a meno di siRNA per cella rispetto all'approccio lipofezione alternativo. Tuttavia i dati della figura 3 mostra che anche la relativamente piccola quantità di siRNA incorporate per Nucleofection è già sufficiente per dall'80 al 90% knockdown del gene bersaglio. Pertanto, l'importo aggiuntivo di siRNA inserito dalla seconda popolazione dopo la trasfezione chimica è surplus molto probabile ed è quindi più probabilità di causare effetti collaterali indesiderati che di aumentare ulteriormente l'efficienza knockdown. A parte questoformazione di agglomerati intracellulari è già di per sé auspicabile dal momento che tali molecole di siRNA non sono suscettibili funzionali o comunque meno efficiente di molecole di siRNA liberi e possono causare effetti fuori bersaglio. Inoltre, la vera natura di questi agglomerati non è ancora chiaro. E 'possibile che questi punti luminosi rappresentano endosomi che indicano che il siRNA è stato interiorizzato dalle cellule, ma successivamente rilasciare dai endosomi fallito e il siRNA resta intrappolato e quindi inefficace. In alternativa, le macchie potrebbero essere agglomerati che si formano all'interno delle cellule. Valutazioni funzionali del trasfezione chimica sono in sospeso, quindi non affermazioni definitive in materia di efficienza atterramento possono essere ancora fatte, ancora l'esistenza di due distinte popolazioni è già sfavorevole in quanto ciò significa che tutti i risultati descrivono la media di entrambe le popolazioni, ciò non pertanto, corrisponde a una delle popolazioni. Per questo motivo Nucleofection è l'approccio superiore.
<p class = "jove_content"> Tuttavia ci sono anche limitazioni alla procedura di trasfezione qui delineato. Poiché le cellule devono essere in sospensione per cellule aderenti Nucleofection devono essere staccato, che presenti un ulteriore fattore di stress per le cellule. Inoltre, l'intero protocollo è piuttosto in termini di tempo. Poiché trasfezioni non possono essere eseguite contemporaneamente, ma deve essere eseguita rapidamente per evitare danni cellulari, il numero di campioni è limitato a circa 8 – 10 per esperimento. Così, questo protocollo non è adatto per i progetti di screening ad alto rendimento. Per le applicazioni ad alta velocità effettiva diversi sistemi Nucleofector sono disponibili. In primo luogo, vi è il sistema 4D-Nucleofector che offre un formato nastro 16 bene. Per un throughput ancora più grande, ci sono il sistema Shuttle 96 bene e il 384 ben sistema HT Nucleofector. Tuttavia, come questi nuovi sistemi funzionano con elettrodi conduttivi polimero al posto di alluminio e quindi condizioni elettriche, cioè programmi e composition di soluzione Nucleofector, sono cambiate di conseguenza, esso deve essere determinato se il nostro protocollo può essere trasferito a tali sistemi.Tuttavia, nonostante queste limitazioni il protocollo qui presentato non produrre una trasfezione affidabile ed efficace di cellule THP-1, che è superiore a tutti gli altri metodi non-virali. Questo protocollo consente l'indagine degli effetti di espressione genica alterata in cellule THP-1 che in tutti gli altri aspetti differenziare e polarizzano normalmente e quindi mostrano come piccoli effetti collaterali di trasfezione possibile.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Lonza Group Ltd. per sponsorizzare questa pubblicazione coprendo i costi di pubblicazione. Ringraziamo la Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, e la Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur per il sostegno finanziario a SL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Accutase I | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| Amino acids, nonessential | PAA | M11-003 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | TPP | TPP91015 | |
| Fetal calf serum (FCS gold) | PAA | A15-151 | |
| Human Monocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1007 | Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes |
| Human serum off the clot | Lonza | C11-020 | |
| Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine | Lonza | 12-722F | |
| Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3) | Lonza | CC-3211 | |
| Mouse T Cell Nucleofector Medium | Lonza | VZB-1001 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | AAD-1001 | |
| Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100×) | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685 | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640) | PAA | E15-840 | |
| siRNA / plasmid | |||
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| THP-1 human leukemia monocytes | CLS | 300356 | |
| Tissue culture flasks (75 cm²; 150 cm²) | TPP | TPP90076/TPP90151 | |
| Tissue culture plates (6-well; 12-well) | TPP | TPP92406/TPP92012 | |
| Tubes (1.5 ml) | StarLab | S 1615-5500 | |
| Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer | |||
| X-Vivo 20 with Gentamycin | Lonza | BE04-448Q | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
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