В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах
Summary
Аксонов транспорт BDNF, нейротрофического фактора, имеет решающее значение для выживания и функции нескольких нейронных популяций. Некоторые дегенеративные заболевания отмечены нарушения аксонов структуры и функции. Мы продемонстрировали методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов.
Abstract
BDNF играет важную роль в нескольких аспектах выживание нейронов, дифференцировку и функции. Структурные и функциональные дефициты в аксонов все чаще рассматриваются в качестве раннего признака нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и болезнь Хантингтона (HD). Пока неясно, является механизм (ы), по которому аксональное повреждение индуцируется. Мы сообщили о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), которые могут быть использованы для отслеживания аксонов транспорт BDNF. Квантовая точка меченных BDNF (QD-BDNF) было произведено сопряжением квантовую точку 655 до mBtBDNF. Микрожидкостных устройство используется для изоляции аксонов от нейрона клеточных тел. Добавление QD-BDNF в аксонов отсеке допускаются Живая съемка BDNF транспорта в аксонов. Мы показали, что КТ-BDNF переехал существу исключительно ретроградно, с очень немногими пауз, по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек. Эта система может быть использована для исследования мнеchanisms из разрушенного аксонов функции в AD или HD, а также других дегенеративных заболеваний.
Introduction
Нейроны очень поляризован ячейки, долго и часто весьма подробно процессы являются основой для установления и поддержания структуры и функции нейронных цепей. Аксон играет жизненно важную роль в перевозке грузов в и из синапсов. Белки и органеллы, синтезированные в клетке сомы необходимо транспортировать через аксонов, чтобы достичь пресинаптического терминала для поддержки функции нейронов. Соответственно, сигналы, полученные в дистальных аксоны должны быть трансдуцировали и передал сомы. Эти процессы имеют важное значение для жизнеспособности нейронов, дифференциации и технического обслуживания. В том, что аксонального транспорта в некоторых нейронов должна быть проведена через расстояния более 1000 раз больше диаметра тела клетки, возможность легко Предполагается, что даже незначительный дефицит может заметно повлиять нейронов и схемы функцию.
Головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), член нейротрофина семейства факторов роста, присутствует в мАNY области мозга, в том числе гиппокампа, коры головного мозга, и базальных отделах переднего мозга. BDNF играет решающую роль в формировании познания и памяти, поддерживая выживание, дифференциацию и функцию нейронов, которые участвуют в познавательных схем. BDNF связывается со своим рецептором, в тирозин-киназы TrkB, в аксона, где он активирует TrkB-опосредованного пути передачи сигналов, включая митоген активированной протеинкиназы / внеклеточной регулируемой протеинкиназы (МАРК / ERK), фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и фосфолипаза С-гамма (PLCγ). Белки, которые участвуют в этих сигнальных путей упакованы на эндоцитотических везикулярного структур для формирования BDNF / TrkB эндосомы 1-6, которые затем ретроградно транспортируется к нейронов сомы сигнализации.
Микрожидкостных культура камера представляет собой очень удобную платформу для изучения аксонов биологию в нормальных условиях, а также при установлении травм и болезней, 7,8. По изолирующих аксоновот клеточных тел, устройство позволило изучить транспорт специально в аксонов 8-10. В основе PDMS микрожидкостных платформы с 450 мкм Microgroove барьеров, используемых в данном исследовании были коммерчески купил (см таблицу материалы). Чтобы изучить BDNF транспорт, мы разработали новую технологию для производства monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Мы воспользовались биотин акцепторной пептида, AP (также известный как AviTag). Это последовательность кислоты в 15 аминокислотных который содержит остаток лизина, которые могут быть специально лигировали с биотином по кишечной палочки фермент, биотин-лигазы, Бира. Мы слиты с AviTag к С-концу мыши предварительно proBDNF кДНК с помощью ПЦР (фиг.1А). Конструкцию клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, pcDNA3.1 MYC-вектора его. Мы также клонировали бактериальную ДНК Бира в pcDNA3.1 Мус-его вектора. Два плазмиды временно совместно трансфицировали в клетки HEK293FT выразить как белки. Бира катализирует перевязка БиоВ частности, в лизина находятся в пределах AviTag на С-конце ФРГМ в соотношении 1: 1, с получением monobiotinylated BDNF мономера. Биотинилированное, зрелые BDNF с молекулярной массой ~ 18 кДа был восстановлен и очищен от СМИ с использованием Ni-смолу (Рисунок 1в). Биотинилирование BDNF была завершена, о чем судили по невозможности обнаружить без изменений BDNF с помощью иммуноблоттинга (Фигура 1D). Стрептавидином сопряженных квантовых точек, QD 655, были использованы для обозначения mBtBDNF сделать КТ-BDNF. Наличие AviTag не вмешиваться в деятельность BDNF как mBtBDNF смог активировать фосфорилированную TrkB (Рисунок 1E) и стимулировать рост аксонов (Рисунок 1F) в той мере, рекомбинантного человеческого BDNF (rhBDNF). Иммуноокрашивание показали, что КТ-BDNF локализуется с TrkB в гиппокампа аксонов, указывая, что QD-BDNF является биологически активным (Рисунок 1G). Для изучения BDNF транспорта, КТ-ФРГМ был добавлен в дистальном отделе аксоновмикрофлюидных культуры, содержащие крысы E18 нейронов гиппокампа (рисунок 2А). QD-BDNF ретроградного транспорта в аксонов был захвачен в реальном времени живого изображения красной флуоресцентной метки (Поддержка видео S1, S2). Анализируя кимографе сгенерированный, QD-BDNF наблюдалось транспортировать ретроградно по движущейся скорости около 1,06 мкм / сек (Рисунок 3А). GFP или mCherry-меченый BDNF были использованы для отслеживания аксонов движение BDNF. Основные недостатки в том, что они не являются достаточно ярким для единичных исследований молекул. Кроме того, присутствие обоих антероградной и ретроградных движений BDNF делает его трудно оценить, был ли ретроградно транспортируется BDNF в комплексе нейротрофин / рецептор.
В этом видео мы продемонстрируем методы, используемые для изучения живой торговлей QD-BDNF в микрофлюидных камер с использованием первичных нейронов. Ultrabrightness и отлично фотостабильность квантовых точек макES можно выполнять долгосрочное отслеживание BDNF транспорта. Эти методы могут быть использованы для повышения исследования аксонов функции в AD, HD, и других нейродегенеративных расстройств.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании, мы сообщают о разработке нового методического производить биологически активные, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), который может использоваться, чтобы отследить аксонов транспорт BDNF. По конъюгации белка в квантовой точки стрептавидином, и с использованием микрожидкостных камер…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Юэ (Полин) Ху, Рэйчел Sinit для их технической помощи. Работа выполнена при поддержке гранта NIH (PN2 EY016525) и при финансовой синдромом Дауна исследований и лечения фонда и Ларри Л. Hillblom фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
