Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L'axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l'hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l'endosome ^1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB.

La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies ^7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d'étudier un transport spécifiquement dans les axones ^8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d'étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s'agit d'une séquence d'acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l'extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d'expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l'ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d'exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l'extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l'aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l'incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n'interfère pas avec l'activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d'activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l'hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d'cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l'hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l'étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l'ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu'ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d'évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur.

Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d'effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d'autres maladies neurodégénératives.