يهدف البروتوكول في تحقيق الاستفادة المثلى من البناء ونوعية ميكروأرس الأنسجة للأبحاث العلامات البيولوجية. ويشمل جوانب التخطيط والتصميم، وعلم الأمراض الرقمي، الشرح الشريحة الظاهري، وarraying النسيج الآلي.
يعتمد البحث على العلامات البيولوجية ميكروأرس الأنسجة (TMA). يتم إنتاج الواجبات الشهرية المتكررة عن طريق التحويل من النوى الأنسجة صغيرة من كتلة "المانحة" إلى "المتلقي" كتلة ومن ثم تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلامات البيولوجية. بناء الواجبات الشهرية التقليدي هو عمالة كثيفة، غير دقيق، وتستغرق وقتا طويلا. هنا، ويرد بروتوكول باستخدام الجيل المقبل من ميكروأرس الأنسجة (ngTMA). ويستند ngTMA على تخطيط وتصميم TMA، علم الأمراض الرقمي، وmicroarraying النسيج الآلي. ويتضح بروتوكول باستخدام مثال من 134 النقيلي مرضى سرطان القولون والمستقيم. وتعتبر الجوانب النسيجية والإحصائية واللوجستية، مثل نوع الأنسجة، والمناطق النسيجية محددة، وأنواع الخلايا لإدراجها في TMA، وعدد من البقع الأنسجة، وحجم العينة، والتحليل الإحصائي، وعدد النسخ TMA. يتم فحص الشرائح النسيجية لكل مريض وتحميلها على منصة رقمية على شبكة الإنترنت. هناك، ينظر آن وأنهمotated (علامة) باستخدام أداة قطرها 0،6-2،0 مم، عدة مرات باستخدام مختلف الألوان للتمييز بين المناطق الأنسجة. يتم تحميل كتل المانحة و12 'المتلقية كتل في الصك. يتم استرداد الشرائح الرقمية ومطابقة الصور لكتلة المانحة. arraying المتكررة من المناطق المشروح تلقائيا أديت يؤدي في ngTMA. في هذا المثال، يتم التخطيط ستة ngTMAs تحتوي على ستة أنواع الأنسجة المختلفة / المناطق النسيجية. والمطلوب نسختين من ngTMAs. ثلاثة إلى أربعة شرائح ليتم فحص كل مريض. 3 يعمل المسح الضوئي ضرورية وأداء بين عشية وضحاها. والمشروح كافة الشرائح. وتستخدم الألوان المختلفة لتمثيل الأنسجة المختلفة / مناطق، وهي مركز الورم، والغزو الجبهة، ورم / سدى، الانبثاث العقدة الليمفاوية، الانبثاث الكبد والأنسجة الطبيعية. 17 الشروح / مصنوعة القضية؛ الوقت لشرح 2-3 دقيقة / حالة. يتم إنتاج 12 ngTMAs تحتوي على 4،556 البقع. Arraying الوقت هو 15-20 ساعة. نظرا الى الدقة والمرونة والسرعة، ngTMA هي قويةأداة لزيادة تحسين نوعية الواجبات الشهرية المستخدمة في البحوث السريرية ومتعدية.
على مدى العقدين الماضيين، وكان ميكروأرس الأنسجة (الواجبات الشهرية) لها تأثير ملحوظ على الدراسات التحقيق العلامات البيولوجية. الواجبات الشهرية هي أساسا النسيج "المحفوظات" التي تنتجها نقل المتكررة من الأنسجة النوى الصغيرة، وعادة ما يتراوح حجم 0،6-2،0 مم في القطر، وجزءا لا يتجزأ من البارافين كتل "المانحة إلى TMA" المتلقي "كتلة واحدة (الشكل 1) 1. باستخدام حجم نواة صغيرة، حوالي 500 البقع الأنسجة المختلفة من عدد قليل أو كثير من المرضى مختلفة يمكن المحتشدة في واحدة TMA 2.
استخدام الواجبات الشهرية للدراسات العلامات البيولوجية النذير أو التنبؤية لديه العديد من المزايا. النظر في المثال حيث التعبير عن العلامات البيولوجية البروتين المناعية ليتم تقييمها على 450 مريضا. بدلا من أداء 450 البقع المناعى على 450 الشرائح المريض مقطوع من نفس العدد من القطع، والنوى صغيرة من كل عينة يمكن المحتشدة على واحد Tكتلة MA. ولو أخذت النوى متعددة من كل مريض على حدة، ويتم إنتاج عدد أقل من القطع. هذا له تأثير كبير في التقليل بشكل كبير من التكاليف والموارد الأخرى فضلا عن الحد من الهزال الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك تتيح هذه الدراسات تعمل بشكل مناسب باستخدام عدد كبير من الأنسجة التي يتم تقييمها في ظل نفس الظروف التجريبية.
الواجبات الشهرية لديها العديد من التطبيقات المختلفة. على سبيل المثال، يمكن استخدامها لدراسة مورفولوجية والبروتين التعبير والتعبير RNA والحمض النووي الانحرافات التالية تلطيخ بأصباغ مختلفة، أو بعد المناعية أو مولد اللون وحتى مضان في الموقع التهجين 3-7. وقد استخدمت الدراسات الحديثة أيضا الواجبات الشهرية لاختبار التباين داخل وبين المختبرات في بروتوكولات تلطيخ، ووضع خصوصية أو حساسية الأجسام المضادة لطفرات جينية معينة، وتحديد استنساخ بين الفاحصين من البروتين التعبير في التعاون الدولي <suع> 8-11.
بناء الواجبات الشهرية التقليدية باستخدام الأنسجة المشتقة من المريض هو عملية طويلة متعددة الإجراء خطوة (الشكل 2). ويبدأ في البحث عن الحالات المناسبة الممكنة واختيار الشرائح التشخيص من المحفوظات في معهد علم الأمراض، أو معهد آخر، من حيث استرجاع فيها. الطبيب الشرعي يقيم كل شريحة في حالة ويختار الشريحة الأكثر تمثيلا لأغراض الدراسة. بعد ذلك، يتم وضع علامة على المنطقة ذات الاهتمام باستخدام القلم مباشرة تحت المجهر. هذا غالبا ما يكون صعبا وغير دقيق والنتائج فقط في "التقدير" من حيث ينبغي أن تؤخذ من النسيج اللكمات. بعد ذلك، يتم استرداد الكتل البارافين المقابلة لهذه الشرائح ملحوظ من الأرشيف. يتم إجراء مقارنة سريعة بين كتلة والشرائح. باستخدام arrayer الأنسجة شبه الآلي أو محلية الصنع، واللكم كتلة المانحة في المنطقة يقدر المصالح ونقلها إلى المتلقي TMA كتلة. بناء الواجبات الشهرية باستخدام هذه التقنية arraying هو عمالة كثيفة، تستغرق وقتا طويلا، غير دقيق، وغير مرنة. ويقدر إعداد TMA من 475 نقاط في 3 نسخ ليستغرق حوالي 84 ساعة من العمل.
تم إدخال نهج جديد لبناء الواجبات الشهرية مؤخرا من قبل معهد علم الأمراض في جامعة برن التي تعتمد على ثلاثة عناصر هي: التخطيط والتصميم (أو الاستشارات)، علم الأمراض الرقمي جنبا إلى جنب مع خبرة في علم الأنسجة والآلي TMA arraying 12. معا، ويسمى هذا المفهوم الجيل القادم الأنسجة ميكروأري (ngTMA). أدناه، يوصف بروتوكول للngTMA على أساس مثال على 134 مريضا يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر. هنا، والأورام الأولية وكذلك الانبثاث العقدة الليمفاوية والكبد الانبثاث هي أن المحتشدة في ngTMAs لتحليل العلامات البيولوجية لاحق. بالإضافة إلى ذلك، فإن المطلوب النوى الأنسجة صغيرة من كل مريض لاستخراج الحمض النووي في المستقبل.
في هذه الورقة، ويرد بروتوكول للngTMA. ngTMA هو مفهوم المنشأة حديثا لmicroarraying الأنسجة تشمل التخطيط والتصميم، وعلم الأمراض الرقمية والشرح الشريحة وكذلك النسيج الآلي microarraying 12.
مقارنة microarraying الأنسجة التقليدية، ngTMA يوفر مزايا عديدة. في الخطوة الأولى، مرحلة التخطيط والتصميم أمر بالغ الأهمية. وينصب التركيز على الإجابة على سؤال البحث المستهدفة. هذا ينبغي أن تأخذ في الاعتبار القضايا النسيجية (على سبيل المثال، التي الأقاليم وعدد البقع لا أريد أن تشمل؟)، والتخطيط الإحصائي (على سبيل المثال، حجم العينة؟ كيف يمكنني تحليل عينات بلدي وقت لاحق؟) والاعتبارات اللوجستية (على سبيل المثال، كيف العديد من المؤشرات الحيوية، وبالتالي كم عدد نسخ ngTMA؟). يتم إجراء ngTMA محددة لاحتياجات محددة، سواء كان للفحص العلامات البيولوجية والإنتاجية العالية أو يهدف إلى دراسة جوانب محددة بشأن النسيجية سوى عدد قليل من الاكاديمية المختارة جيداوفاق.
واحدة، إن لم يكن، العيب أهم من microarraying الأنسجة التقليدية هو الدقة المنخفضة التي جعلت علامات على الشرائح النسيجية. يتم إجراء دراسة الهياكل النسيجية، خلايا أو مناطق محددة من المستحيل تقريبا. ngTMA يسمح لدقة عالية لأن توضع الشروح مباشرة على الشرائح الرقمية. وهذا يسمح الباحث لتحديد بالضبط الأقاليم على أن لكمات، بما في ذلك خلايا معينة. في هذا المثال، يتم كمات المناطق المختلفة داخل نفس الكتلة من الأنسجة لarraying، مثل مركز الأورام، وأمام الغزو ومجالات التفاعل ورم / سدى أبرزها وجود مجموعات الخلايا السرطانية صغيرة أو حتى الخلايا واحد. ويمكن تحقيق هذه الدقة فقط باستخدام ngTMA. وثالثا، لأن يتم فحص الشرائح في الصعود إلى منصة رقمية على شبكة الإنترنت، مرر عرض ويمكن إجراء التأشير من خلال الكمبيوتر بدلا من المجهر. البرنامج arraying الأنسجة يوفر للمستخدم وديةويمكن تحقيق التفاعل مع درجة عالية من المرونة، وبالتالي تخطيطات مختلفة وتصميم ngTMA. منذ يتم تنفيذ البناء TMA تلقائيا بواسطة الحفر، وهناك حاجة كبيرة لينخفض بشكل ملحوظ التدريب العملي على المناورة ومقدار الوقت للبناء. الوقت لبناء TMA في هذا المثال هنا هو ما بين 24 ساعة. باستخدام نهج TMA التقليدية وتقدير اللكمات في 15 ساعة، فإن هذا المشروع سيستغرق ما يقرب من 304 ساعة.
ngTMA يمكن تطبيقها لدراسة التعبير البروتين، مرنا أو DNA وكذلك مجموعات من هذه الشكل 9 يوضح العديد من هذه التطبيقات إلى المؤشرات الحيوية المحتملة. يمكن تطبيقها المناعية القياسية لتحديد مؤشر انتشار السرطان باستخدام كي 67. ويمكن استخدام نهج موحد للتحقيق في التعبير البروتين وتضخيم الحمض النووي لجينات مثل HER2. الأنسجة يمكن أن تجمع معا على ngTMA واحدة لخفض التكاليف، واستخدام الأنسجة والموارد الأخرىق. بالإضافة إلى ذلك، مرنا اللونية الموقع التهجين لHER2 وجينات أخرى يمكن أن يؤديها في تحديد النصوص مرنا واحدة في عدد كبير من الحالات باستخدام أقل عدد ممكن من شرائح الأنسجة. المناعية من علامات المناعة مثل CD8 يمكن تصور في سياق المكروية الورم. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية مزدوجة لتسليط الضوء على مناطق معينة من الاهتمام مثل التفاعلات بين الخلايا المناعية (المسمى باللون الأحمر) والخلايا السرطانية (المسمى في البني) في الجبهة غزو السرطان. لم يكن من الممكن القبض على هذه المنطقة ذات الاهتمام باستخدام microarraying الأنسجة التقليدية.
ومع ذلك، هذا البروتوكول يحتوي على بعض القيود. التحدي الأكثر أهمية هو التداخل بين كتلة المانحة والشرائح الرقمية. عدة عوامل يمكن أن تؤثر هذه الخطوة. أولا، ينبغي أن تستخدم أحدث قسم من كتلة لمسح الشريحة. في كثير من الحالات، H & E ليس هو القسم الأخير من كتلة المانحة، راذهص عليه هو وصمة عار المناعى أو غيرها. في هذه الحالة، أيضا شريحة الملون يمكن استخدامه طالما يتم مسح وصمة عار مشاركة وشرحها أو H & E الجديد ينبغي. وينبغي أيضا توخي الحذر عند اتخاذ أقسام الأنسجة والأنسجة قد توسع في حمام الماء مما يؤدي إلى مطابقة تحديا من الشرائح وكتلة. ثانيا، في الوقت الراهن مشاريع تقتصر على 12 كتل المتلقي TMA معالجتها في وقت واحد. يجب تعيين مشاريع أكبر تتجاوز 12 الواجبات الشهرية إلى اسم المشروع الثاني. ثالثا، يجب أن يتم الكتل المانحة باستخدام القوالب وأشرطة القياسية كأداة لا يمكن ضبط نفسها إلى أحجام مختلفة. أخيرا، يجب أن الكتل المانحة يتجاوز ارتفاع الحد الأدنى (4 مم) لتحقيق الحفر الأمثل. في بعض الحالات، وهذا يتطلب reembedding من الأنسجة.
مئات المنشورات على مدى السنوات القليلة الماضية تبرز TMA باعتبارها أداة لا تقدر بثمن لأبحاث العلامات البيولوجية. وقد استخدمت الواجبات الشهرية لدراسة الرئة 13، القولون والمستقيم 7، الفAST 14، 15 البروستاتا والبنكرياس 16، 17 المثانة، والمعدة 18 السرطان، على سبيل المثال لا الحصر. عدد متزايد من الكتاب والجمع بين استخدام الواجبات الشهرية مع تبذل تحليل الصور وخطوات كبيرة في هذا الاتجاه 19-21. ولكن، إلى جانب حفنة من المجموعات البحثية التي نشرت أفكار مبتكرة TMA 22-24، تم إيلاء اهتمام يذكر لتحسين أسلوب TMA نفسها. microarrayers النسيج الآلي، مثل ATA-27 بواسطة Estigen / بيتشر لا توفر تصميم وتخطيط المناسب الآلي واللكم الأنسجة. لكن هذا يمثل فقط 1 جانب من جوانب مفهوم ngTMA.
ngTMA هو تحسن كبير على تقنيات microarraying الأنسجة التقليدية. وهو يتضمن خبرة في علم الأنسجة وتصميم TMA مع مرونة علم الأمراض الرقمية ودقة الشروح الرقمية مع سرعة وموثوقية الآلي البناء TMA. مزيج من ngTMوهناك وتحليل الصور لتقييم البروتين والمؤشرات الحيوية الجزيئية أن تكون أداة قوية لزيادة تحسين نوعية البحوث السريرية ومتعدية في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الجهاز الفني من وحدة أبحاث بالحركة. ماري إيكونومو، خوسيه غالبان، كارولين هامر، دومينيك مولر، ليليان Schöni وفريق المعلوماتية في معهد علم الأمراض في جامعة برن.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |