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의학

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

Published: October 26, 2014
doi:
10.3791/51870
, , , ,
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology,CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Infantile Epilepsies & Brain Plasticity, INSERM U1129, PRES,Paris Descartes University, Sorbonne Paris Cité, CEA, 3Neurosurgery Department, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 4Rare Epilepsies Reference Center, Necker Hospital, AP-HP,Paris Descartes University, 5Neurophysiology Department,La Pitié-Salpêtrière Hospital, AP-HP, Sorbonne and Pierre and Marie Curie University

Summary

우리는 여기서 인간의 간질 대뇌 피질 조직의 다중 전극 배열 녹음을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 간기 및 발작 사건의 간질 조직 절제술, 슬라이스 준비 및 다중 전극 배열 기록은 구체적으로 입증된다.

Abstract

간질은 인구의 약 1 %에 영향을 미치는, 정상적인 뇌 기능을 방해 발작의 발생주기에 의해 특징 신경 질환의 군을 포함한다. 현재 사용 가능한 항 경련제는 신경 세포의 기능을 대상으로 치료에도 불구하고, 간질 환자의 3 분의 1은 pharmacoresistant 있습니다. 이 상태에서, 발작을 생성하는 뇌 영역의 수술 적 절제가 유일한 대안 치료 남아있다. 인간의 간질 조직을 공부하는 것은 지난 10 년 동안 새로운 간질 메커니즘을 이해하는 데 기여하고있다. 사실, 이러한 조직은 자연 간기 간질 방전뿐만 아니라 고전적인 전기 생리학 기술로 기록 할 수 약리학 유발 발작 이벤트를 생성합니다. 놀랍게도, 공간적으로 배열 된 미소 전극의 어레이를 매립 미세 가공 장치이다 다중 전극 배열 (다자간)는, 동시 자극하는 독특한 기회 레코드 필드를 제공 potentials뿐만 아니라 조직의 다른 영역에서 다중 신경 활동 전위. 따라서 MEA의 녹음은 자연 간기의 시공간적 패턴과 유발 발작과 같은 이벤트 및 발작 발병 및 전파의 기초가되는 메커니즘을 연구 할 수있는 훌륭한 방법을 제공합니다. 여기에서 우리는 외과 적으로 절제 조직에서 인간의 대뇌 피질의 조각을 준비하고 다자간의 간기 및 발작과 같은 이벤트 체외로 기록하는 방법에 대해 설명합니다.

Introduction

간질은 수십 밀리 지속적인 동기 신경 방전의 존재에 의해 특징 임상 증상과 관련된 뇌파 (EEG) 기록에 초에서 수십 초를 지속 간헐적 인 패턴 방전되어 간질 발작, 간기 상태를 방해하는 만성 질환이다 와 간기 이벤트 1 불렀다. 그것은 약 1 %의 세계 인구에 영향을 미치는 발작이 환자의 대부분에서 제어하고 있지만, 간질 환자의 약 세 번째는 항 경련제 2에 적절한 반응을 보이지 않는다. 이 상태에서, 그 메커니즘 아직 명확하게 식별 할 수있는 pharmacoresistant 간질하고, 발작 발병 지역으로 확인 된 뇌의 특정 부분의 수술 적 절제가 환자에게 긍정적 인 결과를주는 유일한 대안 치료 유지했다. 따라서, 수술 절제술은 oppor를 얻을 수기 회는 생체 가능한 인간의 중추 신경 조직에 간기 방전 및 발작의 발생과 전파의 메커니즘뿐만 아니라 pharmacoresistance을 연구한다.

공간적으로 분포 된 미소 전극의 배열로 이루어진 복수의 전극 어레이 (다자간)는, 자발 및 유발 된 활동의 시공간적 패턴을 연구하는 것이 우수한 방법을 제공하는, 조직의 여러 부위로부터 전기 생리 활성의 동시 자극 및 기록을 허용 . 이 기술은, 제 신경 세포 배양 활동 (3)의 발달 변화를 모니터링하도록 도포 한 후 급성의 Organotypic 뇌와 척수 슬라이스 4 적응 – 6, 현재 유용한 전기 생리 공구 여겨진다.

현재의 프로토콜은 수술 절제 조직에서 인간의 대뇌 피질의 조각을 준비하고 다자간 신뢰성 EX의 VI로 기록하는 방법에 대해 설명합니다VO의 간기 이러한 조각에서 발작 같은 이벤트. 이 기술은 따라서 간질 활동 개시 전파 모두 셀룰러 네트워크 레벨에서의 항 간질 약물의 효과의 기초가되는 기본적인 메커니즘을 해결하는 방법을 제공한다. 인간 슬라이스를 얻을 준비 유지하고 기록하는 데 사용되는 모든 절차는 여기에서 상세히 설명된다.

Protocol

참고 : 여기에 설명 된 프로토콜은 프랑스 "자문위원회 (CCT) 국립 디부 Ethique"의 지침을 다음과 INSERM에 의해 수집 활동으로 선언됩니다. 인간의 간질 조직의 1 절제술 환자 난치성 간질을 앓고있는 환자의 뇌 조직을 얻습니다. 수술 전 동의서를 얻습니다. 모든 간질 환자는 신경 학적 검사, 신경 심리 평가, 표면 뇌파 및 뇌 영상을 포함한 광범위한 수술 전 정밀 검사를 수행 할 운영, 절제된 조직의 수술 후 조직 학적 검사 다음 (MRI 때로는 18 FDG-PET 스캔 그림 1A), (그림 1B) . 참고 : 다양한 탐험 유사 발작 발병 영역 때 그 제거의 이점은 수술 위험을 초과 현지화 때 수술이 표시됩니다. 외과 마이ntain 항 경련제 사전에 작동. 전신 마취하에 수술을 수행 유도를 정맥 내 펜타닐과 유지 보수 다음에 흡입 세보 (6 % 전달 비와 O 2의 100 % 흡입 부분), 정맥 내 펜타닐 (0.3 ㎍ / kg) 및 antracurium (0.5 ㎎ / ㎏),과 (0.5 ㎍ / kg / 시간)과 흡입 세보 (1 MAC). 병변 피질 (그림 1C)의 정확한 위치 파악을 할 수있는 neuronavigation 시스템을 사용합니다. 피부 절개 후, 높은 유출 드릴 개두술 다음에 뼈에 버 구멍을 수행합니다. 조심스럽게 뼈 플랩을 상승, 가위 (그림 1D)와 경질을 엽니 다. 운영 현미경 비정상적인 피질의 식별 및 미세 수술기구 및 초음파 흡인기를 촉진하는 수술 중, 초음파를 사용한다. 응고 sulcal 제한에 따라 PIO-거미 막 비행기를 잘라. R에 subpial 해부를 사용하여elease 병변 주변 피아에서 피질. 혈관 최대한 살려주는, 절제 "일괄하여"한 조각을 수행 할 수있는 비정상적인 피질 아래의 백질을 잘라. 대뇌 피질의 외상 조작을 피하십시오. 고랑 바닥과 과도 피질을 포함하여 pial 표면에 직교하는 방향을 따라 절제 조직에서 1cm 두께의 조각을 잘라. 2. 인공 뇌척수액 유체 슬라이스 준비, 창업 및 녹화 용 (ACSF) 슬라이스 준비를위한 ACSF (mm 단위)를 포함, 자당 기반 ACSF 7,8 1 L를 준비 : 250 자당, 3의 KCl, 25의 NaHCO3, 10 D-포도당, 1 염화칼슘 2, 10의 MgCl 2; 탈 이온수에 상기 염을 용해하고, 적어도 10 분 동안 carbogen와 산소를 용액. 50 ~ 60 분 (또는 15 ~ 20 분 -150 ° C) -80 ° C에서 자당 ACSF의 ~ 700 ml를 넣습니다. 의 나머지 부분을 유지얼음에서 산소에서 솔루션. 참고 : 슬라이스 준비를위한 ACSF가 4 ° C에 저장할 수 있습니다; 이 경우에는,이를 냉각하기 전에, 실험 및 CaCl2를 일의 MgCl 2를 추가한다. 슬라이스 배양 및 녹화 ACSF (mm 단위)를 포함, 기록 ACSF 7,8의 최소 3 L를 준비합니다 (124)의 NaCl, NaHCO3을 3의 KCl, 26, 10 D-포도당, 1.6 염화칼슘 2, 1.3의 MgCl 2; 탈 이온수에서 이러한 염을 용해 carbogen와 솔루션을 산소를. 의 MgCl 2를 추가하기 전에, 0의 Mg 2+ ACSF에 녹음을 수행 할 수있는 몇 가지 ACSF을 유지. 참고 : 배양 / 기록 ACSF가 4 ° C에 저장할 수 있습니다; 이 경우, CaCl2를 그리고의 MgCl 2 실험 일에 추가. 슬라이스 배양 및 녹화 3. 장비 슬라이스 배양을위한 인터페이스 챔버 조각 생체 생활 유지하기 위해 뇌 조각 실을 사용하여 </ 인터페이스 모드에서 EM>. NOTE : 챔버 슬라이스 평탄 영역에서 렌즈 티슈의 시트에 휴식 가열 및 센서 소자와 세라믹 버블을 함유하고 증류수로 충전되어 하부 섹션, 및 상부로 구성되어 챔버의 중앙 (도 2A – B). preoxygenated ACSF 챔버에 들어가는 통해 두 개의 분리 된 미세 PTFE 튜브를 사용합니다. NOTE : 튜브를 가열 된 물에 나선형 챔버의 상부에 도달; 다음, 용액을 출구 우물에 용액을 전달 렌즈 티슈와 모세관 작용에 의해 종료한다. preoxygenated 배지로 슬라이스 연속 관류를 허용하는 연동 펌프에 인터페이스 챔버의 PTFE 튜브를 연결한다. 세라믹 버블 통해 carbogen (95 % O 2 및 5 % CO 2)에 의해 산소를 높은 산소 장력을 유지한다. 참고 :이 예열 및 적신 가스 혼합물에 도달적절한 관통 챔버의 상부 슬라이스. 챔버 발열체 용 커넥터 및 일단에 외부 온도 센서를 갖는 특수 이중 종단 케이블을 통해, 온도 제어기에 챔버를 연결하여 상기 챔버의 상부에서의 온도를 유지한다. 배양 (그림 2C)에 걸쳐 온도를 확인하기 위해 조각 근처에있는 센서를 놓습니다. 다중 전극 어레이 녹음 200 μm의 중심 간 간격으로 12 × 12 매트릭스 형상으로 배열 된 실리콘 질화물 및 내부 기준 전극 (120)과 절연 질화 티타늄 전극 (30 μm의 직경), 평면으로 다중 전극 배열을 사용한다. NOTE : 다른 전극 직경 및 간격과 다른 구성이 가능하다. 특히, MEA 칩은 인체 조직의 큰 조각을 샘플링 넓어 질 수있다. (사전 및 파이 MEA2100-120 시스템을 사용하여 10 kHz에서 전기 신호 획득전용 소프트웨어 (MC_Rack)을 통해 통합 된 데이터 수집 및 아날로그 – 디지털 변환기, 16 비트 데이터의 해상도, 입력 전압 범위와 대역폭 소프트웨어를 통해 조절 가능)로 여과한다 증폭기. NOTE : MEA2100 headstage의 연속 기록 세션을 통하여 슬라이스를 관류하는, 자석 홀더를 통해 가열 가능한 관류 소자의 고정 용 금속판으로 부여된다. 슬라이스와 전극 사이 좋은 전기적 결합을 보장하는 작은 집에서 백금 앵커에 의해 MEA에 조직을 누릅니다. 4. 인터페이스 상공 회의소의 준비 및 해부와 슬라이스 도구 인터페이스 챔버 증류수 인터페이스 챔버의 하부 부분을 채운다. 수위가 완전히 발열체 몰두하고 챔버의 하부와 상부 사이의 접합부 아래 2~4mm인지 확인. 매일 가열에 전환하기 전에이 레벨을 확인,위해서는 가열 소자의 손상을 방지한다. 가스 압력의 미세 조정에 대한 보조 유량 조절기 부여 carbogen 소스에 챔버를 연결합니다. 슬라이스 챔버의 평면 영역을 맞추기 위해 렌즈 조직의 시트를 절단하고, 슬라이스에 도달하기 전에 입력 라인에서 어떤 기포 탈출을 허용하기 위해, 입력 용액 튜브에 근접하여 배치. 렌즈 조직 조각만큼 가닥 면사 두 조각을 절단하고, 챔버의 평면 영역의 주 측면을 따라 맞게 배치. NOTE :이 약간 챔버 내의 관류 액 레벨을 올리는 것을 돕는다. 1 ㎖ / 분으로 연동 펌프의 유량을 설정하고 펌프를 활성화. 챔버의 바닥 부에 물이 산소를 시작. 37 ° C의 온도 조절기의 온도를 설정하고 전원을 켜십시오. 파라 필름 조각으로 인터페이스 챔버의 상부를 덮고 temperat 적어도 30 분간을 기다려야URE 증가 및 안정화. 해부 및 분할을위한 도구 두 미세 집게, 주걱, 작은 숟가락과 블레이드로 구성된 해부 키트를 준비; 두 개의 유리 페트리 접시, 두 브러쉬뿐만 아니라, 시아 노 아크릴 레이트 접착제. vibratome의 매개 변수 설정 : 두께 400 μm의; 주파수, 70-90 Hz에서; 진폭, 0.9-1 mm의 속도 : 0.1 mm / 초. 5. 인간의 대뇌 피질 슬라이스 준비 -80 ° C 냉동고에서 자당 기반 ACSF을 제거하고 슬러시의 정렬을 얻기 위해 섞는다. 병원의 수술 방에가는 것은 조직을 얻을 수 있지만, 유리 병에 ~ 250ml를 넣고 얼음을 가득 듀어 병에 보관, carbogen와 산소를. 한편, -20 ° C에서 나머지를 유지한다. 참고 : 수술 중에 신경 외과 대뇌 피질 조직의 작은 블록을 해부한다. 즉시 실험실로 전송 얼음처럼 차가운 자당 ACSF에서 샘플을 배치합니다. 30 분의 최대 실험실 병원 전송에 필요한 시간을 유지. 실험실에서, 비자금을 가지고 그것을 혼합, -20 ° C 냉동고에서 자당 기반 산소 ACSF을 페트리 접시와 vibratome 버퍼 트레이를 작성 carbogen로 모두 산소를 시작합니다. 조심스럽게 숟가락으로 병에서 인체 조직의 조각을 꺼내 페트리 접시 (그림 2D)에 넣어. 핀셋으로 조심스럽게 슬라이스 동안 저항을 방지하기 위해 혈전, 혈관 및 수막을 제거합니다. 대뇌 피질의 표면을 손상하지 않도록주의를 기울이고, 조직 블록의 측면으로부터 시작-PIA 문제에 이루어진, 수막을 제거한다. 블레이드와, vibratome 시험편 접시에 접착 될 평면을 얻기 조직의 측면을 절단. 참고 : PIA-만에 이루어진 수막이, 대뇌 피질의 표면이 손상되지 않도록주의를 기울이고, 조직 블록의 측면부터 제거됩니다. 만약 TI의 블록ssue은 MEA 챔버보다 큰, 시료 판 (도 2e)에 그것을 붙이기 전에 적절한 크기의 조각을 잘라. 횡 피질 슬라이스를 얻기 위해 조직 접착제 버퍼 트레이에 넣고 저속 (0.1 mm / 초) (도 2F)에서 400 μm의 두께 잘라 슬라이스. 조각의 크기와 렌즈 조직의 조각을 잘라; 주걱 브러시와,이 렌즈에 조직 조각을 전송 및 기록 (도 2G – I)을 시작하기 전에 최소한 1 시간 동안 37 ° C에서 인터페이스 챔버에서 그들을 부화. 지속적으로 사용할 때까지 동일한 조건에서 슬라이스를 저장합니다. 참고 : 렌즈 종이에 조각을 배치하는 것은 조각의 바닥면의 관류 및 촬영하기 전에 인터페이스 챔버에서 조각을 제거하는 모두를 촉진하는 중요한 단계입니다. 렌즈 조직의 조각을 전송하는 동안, 함께 대뇌 피질의 레이어 영역을 터치 피하고, 매우 신중하게 관리브러시. 한번에 하나씩 조각을 준비하고 즉시 적절한 산소 공급과 온도를 확보하기 위해, 인터페이스 챔버에 그들 각각의 전송; 가능한 한 빨리 절제된 조직의 블록을 조각. 레코딩을위한 MEA 설정 6. 준비 컴퓨터에 연동 펌프와 MEA 시스템 관류 시스템 플러그. 기록 ACSF을 네이트. 앰프 내부에 빈 MEA 칩을 놓습니다. 가열 뉼러 소자 MEA 챔버에서 37 ° C에 도달 5-6 ㎖ / 분으로 관류를 시작하는 온도 제어기를 설정한다. NOTE : 그것은 온도를 설정하는 것이 필요하다 3-4 ° C 실온 유량에 따라, 목적하는 것보다 더 높은. 전극 영역을 건드리지 않고, 그 중심에 가능한 가장 가까운 배치, 미세 온도계 MEA 실의 온도를 확인합니다. softwar 기록을 시작e와 모​​든 MEA 전극이 잘 연결되어 있는지 확인하고 관류에 의한 소음이 없다는 것을. 카메라 테이블의 기능을 확인하는 MEA_Monitor를 시작합니다. 녹음을위한 MEA 칩 인터페이스 상공 회의소에서 슬라이스 7. 전송 일부는 유리 페트리 접시에 ACSF를 기록 데워 부어; 포셉, 렌즈 티슈 통해 잡아, 인터페이스 챔버로부터 슬라이스를 취하며 배양 접시에 넣어. 조심스럽게 조직에서 슬라이스를 분리합니다. 인터페이스 챔버 내의 용액의 레벨이 신중 배양 시간 동안 조정되는 경우, 슬라이스은 용액에 침지하여 렌즈 조직으로부터 분리된다; 그렇지 않으면, 박리를 용이하게하기 위해 작은 붓을 사용한다. 일부 ACSF와 MEA 칩을 작성하고 주걱으로, 그것으로 조각을 전송합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 가볍게 슬라이스가 전극 면적에 부착하고 백금 ANCH 제자리에 유지 용액을 제거나. , 기록 ACSF의 1 ML을 추가 앰프로 MEA 칩을 놓고 5-6 ml / 분에서 관류를 시작합니다 (그림 2J – L). , MEA_Monitor를 사용하여 MEA 기록 영역에있는 슬라이스 위치를 확인 필요 피질 층으로부터 기록하고 사진을 촬영하기 위해 그것을 조정. 녹음을 시작합니다.

Representative Results

(전술 한 바와 같이) 정상 기록 ACSF와 조직 7,8를 관류하는 동안 인간의 대뇌 피질의 조각 활동의 녹화가 시작됩니다. 조직이 아니라 병원과 슬라이스 조제에서 티슈 전송 중에 나중에 수술 중에 보존되고,이 상태에서, 하나의 MEA 전극의 작은 클러스터로부터 검출 작은 간기 같은 이벤트의 형태로, 자발적인 활동을 관찰 할 수있다. 간기 형상 방전이 수십 밀리 초 지속 긴 대향 파 이어 마이크로 볼트 수십, 도달 초기 날카로운 마이너스 편향을 포함하는, 필드 전위 보통 이상성으로 이루어져 있었다. 고속 멀티 유닛 활동은 일반적으로 주로 초기에 전위 필드에 매립된다. 간기 유사 활성의 대표적인 예는 MEA 전극에 의해 기록 추적이 도시되어 3Aii도에 도시되어있다. 에에서 간질 발작을 기록하려면인간 대뇌 피질의 조각을 시험 관내, 그것은 "간질"ACSF 그들을 관류 할 필요가있는 Mg를 2+ 부재와 K +는 티슈 흥분성 1 (K + 3-6 mm의 증가를 촉진하기 위해, 6 mm로 상승 단독 발작을 유도하기에 충분하지 않다 데이터는 도시되지 않음). 0의 Mg 2 + 6 mM의 K + ACSF와 관류가 시작되면, 5 명에서, 대뇌 피질의 조각의 활동이 점차 증가하고 첫 번째 발작이 20 분 (15.4 ± 1.7 분에 15에서 나타납니다, N = 10; 그림 3 아이 ). 시험 환자의 75 %에서 모든 기록 슬라이스의 66.7 %로,도 3에 도시 된 바와 같이 우리는 발작 – 유사 활성을 유발. 간질 활동은 MEA 칩의 인접 전극에서 기록, 현장 잠재적 인 이벤트의 발병 역학의 비교 기원과 전파의 자신의 사이트를 공부 허용한다. 험의 조각에서 기록 대표 발작MEA 시스템과 대뇌 피질 (그림 3 AIII에 높은 시간 해상도에 표시되는 단일 MEA 전극에 의해 기록 발작의 대표 추적) 그림 (b)에 표시됩니다. 발작은 따라서 그것은 큰 피질 영역으로 전파 될 수 있다는 것을 나타내며, 그 후, MEA 칩의 거의 모든 전극으로부터 기록되어 있습니다. 또, 각 전극으로부터 기록 된 하나의 트레이스를 찾고, 그 조직에 걸쳐 발작의 점진적 전달을 관찰 할 수있다 : 실제로, 상기 전극 어레이의 우측 절반을 덮는 피질 영역에서 먼저 시작하고, 서서히 퍼진다 좌측 절반을 덮는 영역 (.. 즉, 전극 L6 및 B6에서 추적과 비교;도 3b 참조). 그림 1 : 대뇌 피질 이형성증의. 왼쪽 전두엽 고랑에 포함 된 D의 제거 수술 테일러 유형 초점 대뇌 피질 이형성증은 (흰색 화살표) 수술 전 MRI (A) 시각화, 나중에 조직 학적 검사 (B) MAP 키나아제 라벨에 의해 확인된다 스케일 바 : 200 μm의) 낮은 흰색 문제에 불완전한 마이그레이션 뉴런에 대뇌 피질의 dyslamination, 비정상적인 신경과 트랙을 표시합니다. 수술하는 동안, 이형성이 neuronavigation 시스템 (C)와 MRI 데이터에 따라 편재. 수술 (D) 중에 이형성증 함유 이랑 시각화. 그림 2 :. 인간의 대뇌 피질 슬라이스 준비 용 장비 및 절차 인터페이스 챔버가 인간의 대뇌 피질의 조각을 유지하기 위해 사용되는 생체 (A); 온도 센서 (왼쪽 C는), 이중 통하여 온도 제어기 (최대 C, 오른쪽)에 접속 된 챔버 (B)의 상부에 평면 영역에서 렌즈 티슈의 시트에 조각 나머지 종단 케이블 (C, 오른쪽, 아래), 슬라이스 배양 시간에 걸쳐 37 ° C를 유지하기 위해 배치됩니다. 일단 얼음처럼 차가운 자당 기반 ACSF (D) 가득 배양 접시에있는 조직의 절제 블록을 배치하고 분할을 용이하게하기 위해, 혈전, 혈관 및 수막을 제거 얻을. 조직 블록은 MEA 챔버보다 큰 경우, 블레이드 (E)와 적당한 크기의 조각을 분리하고 vibratome 시험편 판 (F)에 접착제. 400 μm의 두께 슬라이스를 잘라 주걱 (G)의 도움으로 렌즈 용 티슈 (H)의 조각을 전송하고 인터페이스 챔버 (I)에서 그들을 품어. 녹음, 레모 전ACSF 가득 배양 접시에 슬라이스를 잠수하여 렌즈 용 티슈를했습니다 주걱 (J)와 ACSF 가득 MEA 칩에 전송합니다. 슬라이스가 MEA (K)에 부착 백금 앵커를 사용하여 계속 그 상태를 유지하도록하는 솔루션을 제거합니다. 앰프 (L)의 MEA를 놓고, 관류 녹음을 시작합니다. 그림 3 : 인간의 대뇌 피질의 조각에서 간질 발작의 MEA 녹음 (A) MEA 전극에 의해 기록 된 인간의 대뇌 피질의 조각 활동의 대표 추적이 패널 I에 표시됩니다.. 정상 ACSF의 존재에서, (패널 II 확대 작은 회색 사각형) 간기 같은 운동량을 관찰하는 것이 가능하다; 다음, 0의 Mg 2+ 6 mM의 K + ACSF 함께 관류가 시작, 제 seizu다시 ~ 15 분 지연 후 나타나는 2 ~ 3 분 간격으로 다른 이벤트가옵니다. 패널 III는 확대 된 규모와 패널 I에서 큰 회색 사각형의 발작을 보여줍니다. 청색 라인과 화살표로 표시된 바와 같이 청색 트레이스는, 활동의 줌을 나타낸다. 패널 IV)는 (블루 추적)를 확대 할 때 멀티 유닛 활동을 공개 250 Hz에서 여과 패널 III에 예시 된 데이터) 하이 패스를 보여줍니다. (B) 0의 존재의 Mg 2 + 6 mM의 K에서 발작의 대표 녹음 + 모든 MEA 전극에서 ACSF. 각 사각형은 12 × 12 어레이의 MEA 전극을 나타내며 80 초 시간 윈도우를 나타내는 도면 점선은 비교적 MEA 배열 피질면의 위치를​​ 나타낸다.

Discussion

Pharmacoresistant 간질은 체외에서 인체 조직 탐구 할 수있는 드문 상태이다. 이것은 부분적으로 만 동물 모델에서 재현되는 특정 결함을 표시 간질 인간의 대뇌 피질을 공부 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 제조 및 인간 수술 조직을 기록 가능 생체 보존 세포 생존 및 네트워크들이 자발적 간질 활동을 생성하도록 함께. 생체 내에서 기록 된 것보다 유사한 활동을 유지하는 것은 병적 인 활동의 기원의 메커니즘을 연구하는 것이 중요하다. 또한, 이러한 방법은 인간 조직을 탐험하고 질병의 비 완벽 동물 모델을 피할 수있다. 그러나, 인간의 조직을 공부하는 것은 신경 외과 및 실험 실험실 간의 동기화가 필요합니다. 조직의 교통 외상으로하지 특정주의가 필요합니다. 또한, 시료의 양 및 조직 모두 제한된다. 마지막으로, 적절한 제어 조직에 대한 액세스는 마이입니다N 우려. 이러한 준비와 함께, 수술 후 조직이 자발적으로 정상 ACSF 7,8에서 간기와 같은 방전을 생산하고 있습니다. 발작 간기 상태로부터 발작 개시 및 전이의 메커니즘을 조사 할 수 있도록 발작 같은 이벤트는 수정 proconvul​​sive ACSF에서 도출 될 수있다.

인간 조직 인터페이스 조건에서 최대 10 시간 동안 생존 유지 될 수있다. 멀티 유닛 활동 또는 필드 잠재력이 자발적으로 관찰했을 때와 같은 활동은 세포 외 칼륨의 증가 및 / 또는 마그네슘 감소를 통해 흥분을 증가시켜 유발되었을 때 조각이 가능한 것으로 간주되었다. 활동의 변화 가능성 병리 및 대뇌 피질 영역의 차이를 반영, 발생하지만, 우리는 자연 간기를 보여주는 건강한 조각에서 조직의 간질 특성을 탐구하고 발작 방전을 유발. 티슈 생명력과 활성을 유지하기 위해, 인터페이스 챔버 t 저장하는데 사용그는 MEA 시스템에 기록하기 전에 복구를 위해 36 ~ 37 ℃에서 조각. 실제로, 몇몇 그룹이 명확하게 자발적인 예리한 파형 잔물결 또는 콜린성 – 유도 진동 -9,10- 같은 표준 비이커 스토리지 및 네트워크 활동의 보존 온도의 중요성에 비해 인터페이스 기반의 저장 시스템의 장점을 증명 하였다. 슬라이스 인터페이스 저장 이전 인간 해마 및 subicular 슬라이스 1,11에서 간질 활성을 기록하는 데 사용되어왔다. 현재 MEA 기술로, 인터페이스 조건 슬라이싱로부터 회복 기간 후, 네트워크 활동은 MEA 시스템과, 37 ° C에서 높은 유속 (5-6 ml / 분)의 존재하에, 잠수 상태에서 기록된다. 함께 증가 된 유량, 작은 체적 챔버 (<1.5 ml)로 구분하는 MEA 칩의 감소 된 직경 (1.8 cm)는, 자발하여 PHA위한 중요한 요소 인 것으로 입증되었다 슬라이스의 산소 공급을 강화네트워크 활동 9,10 rmacologically 유도. 또한, 순환 ACSF 감소량 약리 시험을 용이하게한다.

분할 절차는 그러나 조직 12 traumatism입니다. 신경 세포의 구조와 염화 항상성 모두 조직 표면 (50 μm의)에서 교란 한 것으로 나타났습니다. 대부분 피상적으로 깊이 침투하지 않고 조직, 충격 영역에서 발생할 수있는 샘플 MEA 칩에 의해 기록 된 활동의 기원. 그러나, 우리의 데이터는 우리의 준비에 기록 발작이있을 가능성이 있음을 시사 세포 외 필드 전위가 로컬로 가장 MEA 전극과 그들이 기록 사이트 (13)에서 100-200 μm의 거리에 걸쳐 통합되어 이전의 연구 쇼에 기록 탐지 된 것을 보여 상처를 입은 지역에 의해 생산. 또한, 깊은 용입을 가능 텅스텐 전극 수행 연구에서, 사람 조직에 기록 된 활동은 간질 유사간질 환자 -1,7,8,8-에서 관찰 된 것들.

생체 조직 기록의 또 다른 한계는 따라서 동적 neuromodulations 제한, 다른 뇌 영역 사이의 연결을 방해한다. 같은 조직에 더 발작과 같은 이벤트가 자발적으로 기록되지 않지만 이온 조작 또는 약물 자극 향상 흥분에 의해 트리거 될 필요 이유를 설명 할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜에서, 발작과 같은 이벤트가 티슈 흥분성을 증가시키기 위해, 세포 외 K + 3 내지 6 mM의 변화와 -free ACSF 2+ 1.3 mM 내지 Mg를 외부의 Mg 2 +의 감소를 조합함으로써 유도 Mg를 2 + 의존성 NMDA 수용체 블록을 제거합니다. 실제로, 이전 간질 활동 -free ACSF 생체 (14)에 기록 된 전자 기록 발작 유사한 2+의 Mg를 사용하여 인간 신피질 및 해마 슬라이스에 유도하는 것이 입증되었다. 게다가그것은 측두엽 조각에서 얻은 그 간질 방전 따라서 체외에서 pharmacoresistant 발작 같은 사건을 조사하기위한 모델을 제공, 마그네슘 2+ – 무료 ACSF (15, 16)에 장기간 노출 된 후 임상 적으로 사용되는 항 경련제에 내성을 보였다.

다자간는 신경 세포의 활동 전위 전 생체 내에서 이루어진 현장 잠재력과 멀티 유닛 활동을 모두 기록 할 수 있습니다. 따라서, 다자간는 생체 내에서 신경 앙상블의 동기 활동에 의해 생성 된 필드 잠재력을 탐구하지만, 하나의 뉴런에 대한 액세스 (17) 행동들 제공하지 않습니다 뇌파에 비해 강력한 전기 생리 도구입니다. 최근 미세 전극이 신경 세포의 활동 전위에 구성된 생체 멀티 유닛 활동을 기록 할 수 있지만 그들의 사용은 주로 두개 내 녹음 중 연구 목적에 제한되어 있으므로, 그들은 침략 있습니다. 특히, MEA의 녹음을 선택하는 기술을 나타내는간질 이벤트의 시공간적 패턴을 연구하기 위해, 발작 발병 및 전파 클래식과 새로운 항 경련제의 작용을 제어하는​​ 메커니즘. 놀랍게도, 세포 유형 및 간질 방전의 시그널링 기초 해명 정렬 기법 스파이크 및 약리학 적 시험은 MEA 기술과 결합되어야한다. 다자간 개별 스파이크에 대한 액세스 권한을 부여 할 수 있지만, 그들은 시냅스 및 생물 물리학 적 특성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 미래에, 다른 기술들은 더 샘플 셀룰러 동작, 네트워크 활동과 시냅스 시그널링을 위해 MEA 녹음에 결합되어야한다. 예를 들어, 형광 이미징은 MEA의 녹음과 결합 될 수 있고, 신경 세포 또는 신경교 세​​포의 동작뿐만 아니라, 이온 역학을 해명한다. 간질 활동의 위치가 특정 재 배열과 상관 될 수 있도록 또한 사후 조직 학적 분석은 또한 세포 유형, 단백질 또는 수용체의 특정 변화를 밝힐 수신경 구조. 다자간 시스템은 또한 인구 활동을 단일 세포 또는 전도도의 상관 관계를 패치 클램프 설정에 포함 할 수 있습니다. 미래에는 optogenetic 도구는, 사용의 Organotypic 슬라이스에 대해 수행 같은 특정 세포 유형의 형질 감염 또는 수행 할 수 있도록 인간의 슬라이스, 장기적으로 배양 될 수 있음이 제공 될 수있다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 ANR (프로그램 블랑 신경 과학), FRC (라 공들인 쉬르 르 Cerveau을 부어 연맹)에서 보조금에 의해 지원되었다, 파리 (프로그램의 출현)의 도시, INSERM과 Neuropôle 드에서 NR 라 Pitié Salpêtrière 병원 (중개 연구 계약) 대학 학자 피에르 등의 마리 퀴리 UPMC (프로그램 컨버전스)과 인스 티 투트 뒤 Cerveau 등 전자 라 Moelle epiniere (파리)에서 GH에에서 ED에 공들인 Francilien (NERF)

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Brain Slice Chamber-2: Interface AutoMate Scientific, Inc. S-BSC2 It requires separate temperature controller
2-channel Temperature Controller Multichannel Systems, Germany TC02 It allows to plug in and use 2 interface chambers. 
Special cable for connection of TC01 to S-BSC2 with external reference PT100 Multichannel Systems, Germany CA3 The reference PT100 is placed near the slices 
6pin plug-connector with PT100 Multichannel Systems, Germany TS-PT100 External reference for CA3 cable
MEA workstation for recording data from 120-electrode MEAs Multichannel Systems, Germany MEA2100-120 It includes MEA2100-120 headstage and MEA2100 interface board. www.multichannelsystems.com
Microelectrode array for MEA2100-120 Multichannel Systems, Germany 120MEA200/30 Electrode spacing: 200 µm; electrode diameter: 30 µm; glass ring: 6 mm high. Different configurations (spacing, diameter, ring) possible. 
Video Microscope Table Multichannel Systems, Germany MEA-VMT-1 Table with a video microscope underneath to image the electrode field of the MEAs in an amplifier placed on top of the table and transfer the image to a computer.
Perfusion cannula Multichannel Systems, Germany PH01 Heatable perfusion cannula with temperature sensor; temperature can be programmed with TC02 controller
MC_Rack Multichannel Systems, Germany Software for data acquisition and recordings
Magnetic Perfusion Holder Multichannel Systems, Germany MPH Magnetic perfusion holder for PH01 element to fix the perfusion cannula and connect the perfusion system to the amplifier's ground
Neuroexplorer Nex Technologies Software for data analysis; info@neuroexplorer.com
Peristaltic pump (drive unit) Gilson F155001 0,01 to 48 rp
Peristaltic pump (pump head) Gilson F117800 R2 two channel
Ultrasonic aspirator Integra Life sciences, USA Cusa Excel + It allows blunt subpial dissection of the cortex
Neuronavigation Isis Solutions, France Surgiscope It allows real time identification of the brain structure on the preoperative MRI
Vibratome HM 650 V Microm Block slicing into 400 μm thick slices
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References

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Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (92), e51870, doi:10.3791/51870 (2014).
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